東營石油污染區(qū)微生物多樣性及優(yōu)勢(shì)菌假單胞菌對(duì)甲苯的降解

張 曉

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系， 山東 日照 276826)

石油是一種由大量的烴類和少量其他有機(jī)物組成的復(fù)雜混合物[1]。石油中最常見的污染物質(zhì)為苯、甲苯、乙苯和3種異構(gòu)體二甲苯(以上芳烴合稱BTEX)[2-3]。隨著石油的開采和對(duì)其用量的增加，許多的石油及其加工品進(jìn)入到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，也給人類及其它生物帶來了危害。

土壤石油污染的來源主要包括：在石油的開采、運(yùn)輸及使用過程中溢出和泄漏的石油直接進(jìn)入到土壤，對(duì)土壤造成嚴(yán)重的污染；含油礦渣的滲入；石油冶煉、石油化工廠的生產(chǎn)過程中的可揮發(fā)成分進(jìn)入大氣后通過降塵進(jìn)入土壤中；含油污水的灌溉；工業(yè)垃圾的滲入等。

國內(nèi)外很多研究表明，石油及其產(chǎn)品進(jìn)入土壤后，能夠降低土壤中微生物的多樣性，使微生物群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，降解菌群逐漸成為群落中的優(yōu)勢(shì)菌群[4]。隨著石油及其產(chǎn)品對(duì)環(huán)境的污染越來越受到重視，相關(guān)的治理方法得到了廣泛應(yīng)用，主要包括3類：物理、化學(xué)和生物治理。其中，利用土壤微生物修復(fù)方法治理石油污染土壤得到了越來越多的關(guān)注[5]。土壤的微生物修復(fù)是利用土壤中的各種微生物對(duì)污染物進(jìn)行吸收、降解和轉(zhuǎn)化，從而使污染物的濃度降低或轉(zhuǎn)化成無害的物質(zhì)。大部分降解石油的微生物是在好氧的條件下，將有機(jī)物逐步降解，但也有一部分微生物可以在厭氧的條件下利用各種石油烴類物質(zhì)做能量，使石油污染物被降解。BTEX的有氧降解主要是通過單加氧酶(主要是真核微生物)或雙加氧酶(主要原核微生物)將原子氧引入芳香環(huán)中，形成中間物鄰苯二酚，鄰苯二酚再通過鄰位或間位途徑引起芳香環(huán)的斷裂，最終形成三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)。在厭氧條件下，將微生物芳香環(huán)還原并能使其開環(huán)生成脂肪酸。

目前已發(fā)現(xiàn)自然界中能夠降解石油污染物的微生物包括細(xì)菌、真菌和藻類等共100多個(gè)屬，200多個(gè)種[6]。其中降解石油污染物的細(xì)菌有28個(gè)屬，主要包括假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、棒狀桿菌屬、黃桿菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、微桿菌屬等。常見的降解石油的真菌主要包括木霉屬、青霉屬、曲霉屬、毛霉屬及假絲酵母屬、畢赤氏酵母菌屬等共58個(gè)屬[7-8]。

土壤微生物多性包括在棲息地中微生物分類群的多樣性和在微生物分類群內(nèi)的遺傳多樣性，以及包括群落結(jié)構(gòu)的變異性、相互作用的復(fù)雜性、營養(yǎng)水平和共位群數(shù)量、功能多樣性在內(nèi)的生態(tài)多樣性[9-12]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種分子生物學(xué)手段，如RFLP, RAPD，ARDRA, SSCP和DGGE等方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究, 越來越多的降解微生物新物種得到鑒定和應(yīng)用[13-15]。

已有的研究報(bào)道表明石油類污染物能夠改變土壤微生物的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而導(dǎo)致土壤功能的變化[16-17]。本論文對(duì)石油污染區(qū)微生物群落多樣性進(jìn)行了研究，并對(duì)其中降解菌假單胞菌對(duì)甲苯的降解做了分析，以期應(yīng)用于石油烴污染土壤微生物修復(fù)的實(shí)際工作。

1 研究方法

1.1 土壤樣品的采集以及土壤中原有微生物種類的研究

土樣于2011年10月采自山東東營勝利油田油井周圍3km，10km以及東營市區(qū)個(gè)6個(gè)采樣點(diǎn)。用不銹鋼土鉆分別取表層0～20cm土壤，將采集的土壤樣品用無菌采集袋保管于采集箱中立即帶回實(shí)驗(yàn)室，將同樣的5份土樣混勻、分裝，置于4℃保存。稱取定量土樣加熱蒸餾出總揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，以此代表土樣中總污染物含量，所測(cè)土樣中總石油污染物含量如表1所示。表中可以看出，在距離鉆井最近的3km采樣區(qū)，污染物含量最高，而市區(qū)因?yàn)榇髿馕廴镜雀鞣N因素影響，其污染物含量在不同區(qū)域變化較大。

表1 各采樣點(diǎn)石油污染物含量

采用土壤基因組DNA提取試劑盒(MP Biomedicals)按指示方法提取土壤中總DNA后利用通用上游引物(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和下游引物(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分析，用凝膠成像系統(tǒng) (Bio-Rad) 拍照(圖1)，對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析。

圖1 不同采樣點(diǎn)土樣總DNA的DGGE分析

電泳圖像(圖1)分析表明，土壤樣品基因組中共有53個(gè)不同的帶型，每個(gè)土樣均含有15～35 種不同條帶，且相同采樣區(qū)各土樣均存在同樣的高豐度的條帶，表明各土樣具有相似的優(yōu)勢(shì)菌群，種類數(shù)目變化不明顯，這些優(yōu)勢(shì)菌群在不同程度的石油污染土壤中均能夠較好地生存繁殖。同時(shí)在不同樣品采集區(qū)域的微生物群落呈現(xiàn)出較大的差異，體現(xiàn)在某些條帶的增加，缺失以及條帶深淺的變化上。在靠近采油井的地區(qū)，樣品條帶較少，微生物種類較其他地方有所下降，在市區(qū)，微生物種群增多，變化較為明顯。越靠近污染源，所存在的微生物越適應(yīng)于石油污染環(huán)境，趨向于某些穩(wěn)定種類占了主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)而其他微生物的生長受不同程度抑制，微生物種類有所減少。而在市區(qū)，環(huán)境復(fù)雜，各種污染物成分多樣，導(dǎo)致微生物種群數(shù)目明顯增多。

1.2 不同污染程度土壤微生物群落相似性分析

依據(jù)圖1中微生物種群分布，利用Jaccard群落相似性系數(shù)計(jì)算工具，通過SPSS 10.0可以得到3個(gè)不同土壤生境之間微生物群落的相似性系數(shù)。如表2，表3，表4所示，在同類采集區(qū)域的不同采樣點(diǎn)，各微生物群落的相似性系數(shù)較高，表明在相似的石油污染區(qū)域，微生物群落相似性較大，微生物種類和數(shù)量的差異性較小。

表2 距井口3km采樣點(diǎn)微生物相似性比較(p/%)

表3 距井口10km采樣點(diǎn)微生物相似性比較(P/%)

表4 市區(qū)采樣點(diǎn)微生物相似性比較(P/%)

對(duì)不同采集區(qū)域的微生物群落進(jìn)行比較 (表5) 發(fā)現(xiàn)，不同采樣區(qū)域的土壤中微生物含量以及種類差異較大，表明污染物含量對(duì)微生物菌群生長的影響比較顯著，在較為嚴(yán)重的污染區(qū)，微生物種類趨向減少，優(yōu)勢(shì)菌生長狀況良好，較輕污染區(qū)具有更為優(yōu)良的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種16S條帶進(jìn)行序列分析，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些微生物包括假單胞菌屬(Pseudomonas)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，以及一些不可培養(yǎng)微生物等。假單胞菌屬的幾種微生物在環(huán)境中廣泛存在，可催化多種污染物的降解，包括一些不易被其他微生物降解的有機(jī)物質(zhì)。對(duì)單環(huán)芳烴和多環(huán)芳烴的降解，假單胞菌都發(fā)揮著重要作用。

表5 距井口3km、10km及市區(qū)采樣點(diǎn)微生物相似性比較 (P/%)

1.3 假單胞菌對(duì)單環(huán)芳烴的降解

將分離的假單胞菌培養(yǎng)后分別接種入1kg不同甲苯含量的土樣中，置于大田中，在7～9月份測(cè)定甲苯降解狀況發(fā)現(xiàn)，接種惡臭假單胞菌后，在1周內(nèi)甲苯含量下降較快，然后逐漸趨于緩慢降低狀態(tài)，采集土樣稀釋平板涂布發(fā)現(xiàn)，如表6所示，接種后可培養(yǎng)微生物中主要為假單胞菌，菌落數(shù)在3d后開始急劇下降，最終趨于穩(wěn)定。由于最初的高濃度底物甲苯的揮發(fā)以及其被大量微生物迅速代謝，隨著物理?xiàng)l件的變化導(dǎo)致部分假單胞菌死亡，剩余菌種對(duì)甲苯的代謝趨于平穩(wěn)，假單胞菌成為該土樣中優(yōu)勢(shì)菌。

表6 每克土樣中可培養(yǎng)微生物菌落數(shù)

2 結(jié)論

選取東營不同地區(qū)不同污染程度的土壤，測(cè)定土壤中微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)相似的取樣區(qū)域范圍內(nèi)，微生物種群基本保持穩(wěn)定，種類和數(shù)目較為相似。而在污染較為嚴(yán)重的區(qū)域，微生物種群較生態(tài)環(huán)境復(fù)雜的市區(qū)土壤中的微生物群落更為簡(jiǎn)單，具有明顯的優(yōu)勢(shì)菌群，主要是假單胞菌，節(jié)桿菌，鞘氨醇單胞菌以及一些不可培養(yǎng)的未知微生物。

對(duì)甲苯污染土壤接種假單胞菌后研究7對(duì)微生物菌群的影響，發(fā)現(xiàn)接種初期由于假單胞菌能迅速降解甲苯，所以土壤中微生物主要是假單胞菌；2周后逐漸發(fā)現(xiàn)其他微生物，最終各微生物形成穩(wěn)定群落，假單胞菌作為降解菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

強(qiáng)化生物修復(fù)可短期內(nèi)增強(qiáng)降解作用，但增加的微生物在本研究中并不能長期大量在野外存活。

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