早期補(bǔ)救ICSI在男性不育患者IVF-ET中的應(yīng)用*

孫寶剛 王麗霞 曹井賀 張 寧 粱魯南 楊愛軍

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029)

常規(guī)體外受精(in vitro fertilization,IVF)發(fā)生受精失敗的概率約為5%～10%[1],目前不孕夫婦的相關(guān)檢查均不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)IVF結(jié)局。低受精的發(fā)生增加了卵母細(xì)胞的浪費(fèi)，減少了可用胚胎的數(shù)量，給患者的經(jīng)濟(jì)及身心造成損害，因此IVF如何能及早觀察受精情況，并早期進(jìn)行補(bǔ)救，是預(yù)防受精失敗的關(guān)鍵[2]。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)收集在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診的89例不孕不育患者，根據(jù)受精方式不同分為男性不育IVF治療組(A組)22例和男性不育卵胞漿單精子注射( intraoytopplasmic sperm injection，ICSI)治療組(B組)(精子濃度≤15×106/ml，總活力PR+NP<40%或PR<32%；精子總數(shù)≤39×106/次；精子畸形率<96%)。并將以上兩組作為試驗(yàn)組，以完全女方因素引起的IVF治療組(C組)作為對(duì)照組(女性不孕因素有輸卵管因素，其通過HSG或者宮腔鏡、腹腔鏡以及超聲檢查證實(shí))。

1.2 方法

1.2.1控制性超促排卵 試驗(yàn)組與對(duì)照組女方均選擇長(zhǎng)方案超促排卵。于前次月經(jīng)黃體中期肌注促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a) 0.03～0.1mg，月經(jīng)第3天開始使用促性腺激素(gonadotropin，Gn) 150～225 Iu 共5d促排卵，月經(jīng)第5天起，行陰道B超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，并以此及時(shí)調(diào)整用藥。直至有2～3個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑在18mm以上時(shí)，結(jié)合激素檢測(cè)結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟，停用促排卵藥物，于當(dāng)日注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5000～10000Iu。注射HCG后34～36h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，記錄取卵數(shù)。

1.2.2精子處理 將試驗(yàn)組與對(duì)照組的男性精液標(biāo)本采用密度梯度分離法分離。其具體步驟為：取精子密度梯度分離培養(yǎng)基，吸取1ml下層(高密度)分離培養(yǎng)基置于離心管中，再吸取1ml上層分離培養(yǎng)基(低密度)緩慢地注于下層分離培養(yǎng)基的上面，兩層培養(yǎng)基的中間形成一個(gè)清晰的界面，37℃培養(yǎng)箱復(fù)溫。小心吸取1ml培養(yǎng)基化的精液覆蓋于上層分離培養(yǎng)基的液面。以(300～600)g的速度離心20min。移去所有的分層溶液，只剩底部的沉淀。加2～3ml洗精培養(yǎng)基，將沉淀混勻。200g離心5min。移去上清，再加入洗精培養(yǎng)基，重復(fù)離心洗滌步驟。用0.5mlIVF受精培養(yǎng)基懸沉淀。進(jìn)行精于計(jì)數(shù)和精子質(zhì)量評(píng)估。將處理獲得的精子調(diào)整密度(50～300)×103/ml為宜，后置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱待用。

1.2.3受精及胚胎培養(yǎng) A組和C組采用常規(guī)的體外受精。取卵后3h加精子，受精后4～6h后去除卵周顆粒細(xì)胞并觀察第二極體是否排出，所有卵母細(xì)胞均無第二極體排出判斷為完全不受精，排出第二極體卵母細(xì)胞數(shù)與成熟卵母細(xì)胞數(shù)之比<30%判斷為低受精率，告知患者及家屬，如同意補(bǔ)救，簽署書面“早期補(bǔ)救ICSI知情同意書”，對(duì)A組患者未見到2個(gè)極體的卵子行早期補(bǔ)救ICSI治療。B組患者直接采用ICSI治療。

1.2.4胚胎按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí) 形態(tài)學(xué)指標(biāo) 4′-卵裂球大小均勻，碎片為≤5%;3′-卵裂球大小均勻或不等，碎片6%～20%;2′-卵裂球體積相等或不等，碎片21%～50%;1′-卵裂球少，碎片>50%。1、2級(jí)胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況，胚胎評(píng)級(jí)時(shí)在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上降一級(jí):1)授精20h內(nèi)未見到原核，48h證實(shí)為延遲受精的胚胎。2)取卵后48h超過8細(xì)胞或72h未超過5細(xì)胞。正常受精3、4級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。取卵后培養(yǎng)24～48h觀察胚胎形態(tài)，將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。胚胎移植后14d檢測(cè)尿或血HCG陽性，移植后3～5周超聲檢查見胎心搏動(dòng)為臨床妊娠。移植時(shí)先選擇常規(guī)受精來源的胚胎，若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI受精胚胎。

1.2.5受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率的計(jì)算公式 受精率=正常受精卵數(shù)/卵—冠—丘復(fù)合體數(shù)×l00%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組與對(duì)照組患者基本情況比較

兩組患者男、女方年齡、不孕年限、精液量、非前向運(yùn)動(dòng)精子率(%)(NPR)相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液參數(shù)中，精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子率(PR)、正常形態(tài)率、精子存活率相比較，試驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 試驗(yàn)組與對(duì)照組患者基本情況比較

2.2 試驗(yàn)組與對(duì)照組臨床治療結(jié)局比較

22例男性不育患者行IVF受精，其受精率為43.37%，其中有5例受精率小于30%。對(duì)A組受精率小于30%患者實(shí)行早期補(bǔ)救ICSI后A組受精率為63.36%。比較試驗(yàn)組與對(duì)照組治療結(jié)局：兩組優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、多精受精率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中補(bǔ)救前受精率B組及C組均大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是經(jīng)早期ICSI補(bǔ)救后受精率(%)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

精液常規(guī)檢查一直作為一個(gè)很重要的參考指標(biāo)來指導(dǎo)臨床的治療方案。伴隨著男性不育研究的深入，傳統(tǒng)的精液分析已不足以對(duì)男性生育能力做出準(zhǔn)確全面的了解。本文發(fā)現(xiàn)，22例男性不育患者行IVF受精，其受精率為43.37%，其中有5例占行IVF助孕男性不育患者的比例為22.7%(5/22)受精率小于30%，明顯低于B組(73.21%)以及C組(66.19%)，因此，男性不育患者還可能伴有精子功能缺陷，諸如精子與卵子的結(jié)合能力、精子頂體反應(yīng)率明顯下降，精子受精功能降低。精液常規(guī)分析與實(shí)際生育力的僅有70%的符合率[3]。有研究顯示[4]，在IVF受精失敗的病人中，約70%患者是由于精子與透明帶結(jié)合障礙所引起[5]。因此即使精液檢查指標(biāo)均正常，也有可能出現(xiàn)受精失敗。如果這部分患者做IVF治療，其結(jié)果是受精率下降，甚至受精完全失敗，導(dǎo)致無胚胎移植，往往會(huì)給病人帶來精神及經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。

表2 試驗(yàn)組與對(duì)照組臨床治療結(jié)局比較(%)

Chen等[6]報(bào)道受精后22h行晚期補(bǔ)救ICSI 20例，僅成功1例，從而造成晚期補(bǔ)救性ICSI妊娠率和出生率低。而本文A組受精率小于30%，5例患者經(jīng)6h內(nèi)實(shí)行早期補(bǔ)救ICSI后A組受精率為63.36%，與B組以及C組相比無明顯差異，并且之后的優(yōu)胚率與妊娠率和B組以及C組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與嚴(yán)正杰等[7]研究相符，他們發(fā)現(xiàn)IVF失敗的患者，6h內(nèi)盡早行補(bǔ)救ICSI可提高受精率，改善臨床妊娠結(jié)局。因此早期補(bǔ)救ICSI有以下優(yōu)勢(shì)：1)伴有精子功能異常男性不育患者及時(shí)行早期補(bǔ)救ICSI，不僅可以提高受精率并且對(duì)以后的胚胎發(fā)育可能并無影響，這樣大大改善了臨床結(jié)局。2)可以使胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育更為同步，同時(shí)可以避免錯(cuò)過最佳的子宮內(nèi)膜種植窗口。3)由于卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時(shí)間過長(zhǎng)可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生異常，而對(duì)未受精的卵母細(xì)胞行早期補(bǔ)救ICSI則可以降低細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生異常的概率。因此早期補(bǔ)救ICSI可作為IVF失敗后的補(bǔ)救措施。

我們對(duì)于首次行IVF治療的男性不育患者，如果男性不育患者妻子獲卵數(shù)≤5枚，在受精后6h內(nèi)則全部拆蛋觀察；獲卵數(shù)≥5枚者則拆一孔或一皿卵子進(jìn)行觀察。對(duì)其未見到2個(gè)極體的卵子行早期補(bǔ)救ICSI治療。這樣有利于提高受精率，避免完全受精失敗，獲得較好的妊娠結(jié)局，也可為以后的治療提供更好的方案，并且可以降低ICSI的操作率，降低患者的治療費(fèi)用。

綜上所述，在IVF受精后對(duì)未受精的卵母細(xì)胞實(shí)行早期補(bǔ)救ICSI，不但避免了受精失敗導(dǎo)致的無胚胎移植，顯著增加妊娠機(jī)會(huì)，而且還可避免為了提高受精率而過度使用ICSI技術(shù)的情況。早期補(bǔ)救ICSI是一種高效、可行的挽救常規(guī)受精失敗的措施。然而早期補(bǔ)救ICSI技術(shù)對(duì)出生嬰兒的安全性研究隨訪報(bào)道較少，我們尚不清楚在卵母細(xì)胞受精過程中進(jìn)行拆除顆粒細(xì)胞等機(jī)械操作是否會(huì)對(duì)受精卵和胎兒產(chǎn)生遺傳學(xué)方面的不良影響。

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