非小細(xì)胞肺癌組織血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及微血管密度的變化

王 雷 王國范 王秀美 李笑顏 張玉革

(1山東省腫瘤醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250117;2濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250001；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程均與腫瘤血管生成有關(guān)，因此目前對腫瘤血管研究越來越引起大家的重視[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grouth factor,VEGF)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究表明,VEGF是目前腫瘤新生微血管最強(qiáng)的促血管生成因子之一[2]，是研究腫瘤的重要受體。微血管密度( microvascular density,MVD)的測定已成為目前評價腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)。近年來,大家對腫瘤血管生成研究主要集中在腎癌、腦腫瘤、乳腺癌、胃癌等，這些組織中均查到有VEGF高度表達(dá)[3]。CD34是廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種抗原，是一類不同于Ⅷ因子相關(guān)抗原的蛋白質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，利用CD34進(jìn)行免疫組化染色來顯示并計量血管內(nèi)皮細(xì)胞比Ⅷ因子相關(guān)抗原更具有特異性，敏感性也更強(qiáng)[5]。目前，其在非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的研究報道不多[6]。本文觀察了NSCLC組織中VEGF和MVD的表達(dá)，探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集本院自2010年1月1日至2012年7月30日NSCLC手術(shù)標(biāo)本36例，術(shù)后病理證實(shí)為NSCLC，且無癌組織壞死。其中鱗癌15例；腺癌17例(普通腺癌14例、細(xì)支氣管-肺泡癌3例)；腺鱗癌4例。排除術(shù)前有放療、化療及其他抗腫瘤治療史。對照組17例取自同期接受手術(shù)治療的肺部良性腫瘤患者病變周圍5cm 以外正常組織，其中結(jié)核球6例，錯構(gòu)瘤3例，肺平滑肌瘤1例，炎性假瘤7例。所有標(biāo)本由2名病理醫(yī)師會診后確診。

1.2 主要試劑

VEGF 鼠抗人單克隆抗體，鼠抗人CD34單克隆抗體，DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1病理學(xué)檢查 每例標(biāo)本均分為10～15塊組織不等，均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，經(jīng)過免疫組化染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.2免疫組化染色 采用免疫組織化學(xué)SP法。VEGF和CD34染色判定均以細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1VEGF陽性率的判定 先在低倍視野下(100×)找到觀察部位，然后在高倍視野下(400×)每張切片選取5個視野，每個視野下觀察1000個細(xì)胞，染色陽性細(xì)胞數(shù)<20%為(-)，20%～50%為(+)，50%～70%為(++)，>70%為(+++)。

1.4.2MVD計數(shù)方法 以CD34作為血管內(nèi)皮標(biāo)記物，首先在顯微鏡低倍視野(100×)掃視整張石蠟切片，在每張切片找出3個微血管密集區(qū)，然后在高倍視野(400×)下計數(shù)，視野面積為0.443mm2。每張切片均計數(shù)3個視野，取平均值即為MVD計數(shù)[3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織VEGF的表達(dá)及MVD值的變化

見表1。

2.2 不同臨床及病理學(xué)特征的NSCLC患者VEGF、MVD表達(dá)情況比較

結(jié)果顯示，VEGF的表達(dá)陽性率與患者性別、年齡、吸煙之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而在不同組織類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間，VEGF的陽性分布和MVD計數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且VEGF在腺癌中表達(dá)率最高。不同腫瘤的病理分級及TNM分期中VEGF陽性分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病理分級及TNM 分期越高，VEGF表達(dá)分布越多。見表2。

表1 VEGF在肺組織中的表達(dá)及MVD變化

注：*采用Fisher概率法

表2 VEGF及MVD表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

注：*P<0.05；**P<0.01；△P<0.05；△△P<0.01。

2.3 VEGF陽性表達(dá)與陰性表達(dá)組MVD計數(shù)的比較

結(jié)果顯示,36例NSCLC患者中，VEGF陽性者(27例)MVD值明顯高于VEGF陰性者(9例),差異有顯著性(P<0.01)。表明MVD 與VEGF的表達(dá)有一定的關(guān)系。見表3。

表3 VEGF陽性表達(dá)和陰性表達(dá)組MVD值的比較

3 討論

實(shí)體腫瘤的生長過程可分為有血管期和無血管期，腫瘤在無血管期獲取所需的營養(yǎng)的過程主要靠周圍組織的彌散，并通過此途徑排泄代謝產(chǎn)物。當(dāng)腫瘤增長到一定體積時便開始啟動血管生成，使腫瘤生長進(jìn)入血管期；但腫瘤的新生血管并不完整，比正常成熟血管更容易遭受到腫瘤細(xì)胞的破壞，而腫瘤細(xì)胞可沿著新生的血管開啟所謂膠原裂隙發(fā)生侵襲[7]。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體腫瘤的血管生成是普遍存在的特征，血管生成與腫瘤組織的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF作為血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物之一，目前已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8]。

VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、趨化，從而促進(jìn)血管生成，但對血管內(nèi)皮細(xì)胞以外的其他細(xì)胞無促進(jìn)分裂作用。VEGF通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)囊泡小體功能使血管通透性增加[9]，不但可導(dǎo)致間質(zhì)水腫和癌性胸腹水，并且可使血管內(nèi)血漿蛋白外滲，而且能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長提供良好的基質(zhì)。由于腫瘤細(xì)胞在生長時自身不能產(chǎn)生纖維蛋白原，VEGF引起的腫瘤血管通透性的提高，對腫瘤的新生血管形成就顯得尤為重要 ；VEGF還可通過改變內(nèi)皮細(xì)胞基因的活化形式，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)亡[10]。研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其家族成員在眾多生理和病理過程中的新生血管生成中都是必不可少的誘導(dǎo)因子之一，尤其在腫瘤新生血管形成的過程中[11]。人們發(fā)現(xiàn)VEGF雖然可以在很多正常組織中表達(dá)，但表達(dá)水平一般偏低，而在一些血供豐富、代謝旺盛的正常組織VEGF的表達(dá)常均高于其他組織。VEGF在多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞中，無論是mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均有過量表達(dá)[12]。

本文運(yùn)用VEGF在血管內(nèi)皮表達(dá)的特性，探討腫瘤新生血管的形成。通過MVD數(shù)值的測定，探討肺癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本文結(jié)果顯示，VEGF在NSCLC組織中呈高表達(dá)，其MVD值也高于正常肺組織(P<0.05)。VEGF表達(dá)和MVD 值與腫瘤組織學(xué)分化程度有關(guān),在低、中、高分化癌中存在顯著差異 (P<0..01或P<0.05);肺癌組織中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組VEGF表達(dá)和MVD 值顯著高于陰性組(P<0.01 或P<0.05)。因此推測肺癌組織標(biāo)本中VEGF的MVD計數(shù)越多，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會越多，新生血管增生越活躍，腫瘤生長越快，生存期越短，VEGF可能會成為肺癌患者判斷預(yù)后的參考指標(biāo)之一。同時發(fā)現(xiàn)VEGF在肺癌不同病理類型和正常肺組織中均有不同程度的表達(dá)，VEGF在腺癌中的表達(dá)最強(qiáng)，為88.24%；在鱗癌及腺鱗癌中的表達(dá)較弱，分別為60.0%、75.0%；在正常肺組織中的表達(dá)最弱，陽性率為23.5%。通過比較肺癌組織與正常組織、比較不同的肺癌組織類型、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明肺癌腫瘤的生長是一種依賴于新生血管形成的過程，組織局部的VEGF表達(dá)水平高時，血管生長越快，組織生長迅速是肺癌生長的特征。關(guān)于MVD值與腫瘤遠(yuǎn)處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,目前尚無統(tǒng)一定論。本文顯示肺癌MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。目前尚沒有對MVD定量方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果的差異除可能與腫瘤本身的異質(zhì)性有關(guān)外,同時也與研究者所選取的血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物及采用的處理、分析方法異同有一定關(guān)系。

本文結(jié)果提示，VEGF在腫瘤血管發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，有可能成為腫瘤預(yù)后判斷的參考指標(biāo)?？寡苌芍委煵呗允轻槍盒阅[瘤血管生成的關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù)治療，對腫瘤血管生成的阻斷有可能抑制腫瘤的生長，故對腫瘤血管生成的深入研究,有望為肺癌的早期診斷和治療提供幫助。

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