非霍奇金淋巴瘤患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測及臨床意義

李 穎 付 蓉

(1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 30005；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029 )

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是發(fā)生于淋巴結(jié)及或結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與免疫功能異常密切相關(guān)。近年來的研究均表明 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator T cells，Tregs)在腫瘤環(huán)境中會(huì)有一定比例的增加，可使腫瘤免疫發(fā)生失調(diào)情況，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1-3]。但 Tregs 在淋巴瘤中的作用尚無定論。本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測 NHL 患者與健康人外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的比例，比較 NHL 患者與正常人外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的差異及 NHL 患者化療前后 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的變化，探討外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 水平與 NHL 的預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2013年4月至2013年12月收治的初診NHL(B細(xì)胞型)病例共38例為觀察組，包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤18例，濾泡性淋巴瘤7例，黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤6例，脾邊緣區(qū)淋巴瘤4例，套細(xì)胞淋巴瘤3例，所有患者均符合WHO2008 NHL診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床及隨訪資料完整。其中男性21例，女性17例，年齡22～71歲，平均年齡為(45.2±8.9)歲；同時(shí)選取同期健康志愿者20例作為對照組，均為性別、年齡匹配，無自身免疫性疾病、腫瘤病史，近期無感染病史。

1．2 化療方法與療效評價(jià)指標(biāo)

所有 NHL 患者均參照《NCCN 2012非霍奇金淋巴瘤臨床實(shí)踐指南》進(jìn)行6周期化療，化療方案包括：CHOP、CHOEP、R-CHOP、hyperCVAD (其中C：環(huán)磷酰胺；H：阿霉素，O：長春新堿；P：潑尼松；E：足葉乙甙；R：利妥昔單抗；D：地塞米松)?；熀笸耆徑?CR)標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤完全消失超過1個(gè)月；部分緩解(PR)標(biāo)準(zhǔn)：病灶的最大直徑及其最大的垂直直徑的乘積減少50%以上,無新發(fā)病灶，持續(xù)超過1個(gè)月?；?周期后均采用 CT 檢測。

1．3 檢測方法

1．3．1儀器及試劑 流式細(xì)胞儀(BD FACSC Calibur)，CD4-FITC、CD8-PE、CD3-APC、CD25-PE，F(xiàn)oxp3 APC，固定劑、破膜劑及各熒光抗體對應(yīng)同型對照均購自美國Becton Dickinson公司，淋巴細(xì)胞分離液購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．3．2標(biāo)本采集 正常對照組及研究組患者均于清晨采集空腹靜脈血10ml，其中NHL組在化療6周期后再次采血10ml，肝素抗凝，均在6h內(nèi)檢測。

1．3．3標(biāo)本處理及檢測 1)抗凝血用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用PBS調(diào)整PBMC為細(xì)胞懸液(濃度：1×106～5×106/ml)。2)取4支試管編號為1、2、3、4，分別加入100 μl PBMC細(xì)胞懸液，1號管分別加入CD4-FITC、CD8-PE、CD3-APC抗體各20μl；2號管分別加入CD4-FITC CD25-PE抗體各20μl，避光孵育30min。1號管、2號管分別加入溶血素2ml，避光孵育10min，300g離心5min，棄上清，PBS洗滌1次后重懸，1號管待上機(jī)。2號管加2ml新鮮配制固定液，渦旋混勻，避光30min，500g離心5min，棄上清，PBS洗滌1次后重懸，加0.5ml破膜劑，混勻，避光45min，300g離心5min，棄上清，加20μl Foxp3-APC抗體，渦旋混勻，避光孵育60min，加入2ml PBS，500g離心5min，棄上清，加500μl PBS重懸，立即上機(jī)檢測，3號管為膜抗體同型對照，4號管為胞內(nèi)抗體同型對照，同1、2號同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。3)經(jīng)BD FACSDiva軟件分析得出測定數(shù)據(jù)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS18．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 觀察組患者化療前和對照組外周血T細(xì)胞亞群的比較

觀察組患者化療前和對照組相比，外周血CD3+、CD4+細(xì)胞中比例及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。見表1。

表1 觀察組患者和對照組外周血T細(xì)胞亞群的比較

2．2 觀察組患者化療前后外周血T細(xì)胞亞群的比較

化療后完全緩解及部分緩解的觀察組患者外周血中CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例較化療前明顯降低，CD3+、CD4+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+較化療前均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2．3 化療后完全緩解與部分緩解觀察組患者之間的外周血T細(xì)胞亞群比較

化療后達(dá)到完全緩解的患者(CR)和部分緩解的患者(PR)之間，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及CD4+/CD8+無顯著差異，(P>0.05)。見表3。

表2 NHL患者化療前后外周血T細(xì)胞亞群的比較

表3 化療后完全緩解和部分緩解患者之間的外周血T細(xì)胞亞群比較

3 討論

Tregs是指一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用。1975年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抑制性 T 細(xì)胞可妨礙有效的抗腫瘤免疫[4]，Sakaguchi等[5]證實(shí)在自身免疫性疾病中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群通過抑制性調(diào)節(jié) CD4+和 CD8+T 細(xì)胞對免疫起負(fù)調(diào)節(jié)作用。Foxp3是forkhead/winged-helix轉(zhuǎn)錄因子家族成員。研究表明，F(xiàn)oxp3 是CD4+CD25+T細(xì)胞的特異性分子，是后者細(xì)胞發(fā)育和成熟的調(diào)控因子，也是其發(fā)揮抑制和調(diào)節(jié)功能必不可少的分子[6-7]。因此，目前均以CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞定義Tregs。CD4+CD25+Foxp3+Tregs 主要通過分泌IL-10、TGF-β等[8]抑制性細(xì)胞因子，通過細(xì)胞接觸依賴的抑制途徑與效應(yīng)性T細(xì)胞競爭性結(jié)合 IL-2 或直接作用，抑制其增殖并促進(jìn)其無能、誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞向免疫耐受的方向發(fā)展、抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞向腫瘤局部聚集，這些方面抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，促使腫瘤細(xì)胞免疫耐受、逃逸。

Marshall等[9]首次發(fā)現(xiàn)在Hodgkin 淋巴瘤患者浸潤淋巴細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs 數(shù)目增加。隨后的研究表明，在淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病等多種惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者體內(nèi)的Tregs數(shù)量升高，降低 Tregs數(shù)量可以有效地激活機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高患者的長期生存期[1-3]。但Tregs與淋巴瘤的關(guān)系尚存在爭議。

我們采用 CD4、CD25、Foxp3 聯(lián)合標(biāo)記法檢測38例初診NHL患者及20例正常成人外周血 Tregs 占 CD4+T 細(xì)胞的比例，結(jié)果提示初診 NHL患者較正常成人對照組外周血 Tregs 比例升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與 Mittal S等[9]的研究結(jié)果一致。我們的觀察結(jié)果提示：在初診的NHL患者中，存在 CD4+CD25+Foxp3+Tregs介導(dǎo)的免疫抑制狀態(tài)，這種狀態(tài)可能導(dǎo)致了機(jī)體免疫系統(tǒng)對早期突變的惡性淋巴瘤細(xì)胞的免疫忽視或免疫應(yīng)答減弱，從而使免疫系統(tǒng)失去了對惡性淋巴瘤細(xì)胞的清除能力，導(dǎo)致了淋巴瘤的發(fā)生及疾病進(jìn)展。

為了進(jìn)一步觀察Tregs與NHL預(yù)后之間的關(guān)系，本文同時(shí)比較了NHL患者化療前后外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的變化，發(fā)現(xiàn)化療后達(dá)到CR、PR患者較治療前外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例明顯下降，提示接受有效治療患者的免疫抑制狀態(tài)得到一定糾正，其細(xì)胞免疫功能恢復(fù)，從而抑制腫瘤生長或殺滅腫瘤。但在化療后達(dá)到 CR 與 PR 的患者之間 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的比例無明顯差異(P>0.05)。由于本研究中NR 的患者例數(shù)較少，無法有效評估NR患者外周血中Tregs的變化，Tregs是否與NHL患者的不良預(yù)后及原發(fā)耐藥有關(guān)，仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本文結(jié)果顯示CD4+CD25+Foxp3+Tregs 在NHL的發(fā)生、發(fā)展方面中具有重要作用，有可能作為預(yù)后和臨床治療的監(jiān)測指標(biāo)。但其作用機(jī)制比較復(fù)雜，而 Tregs 在不同NHL亞型中的作用存在差異，能否作為NHL的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)仍需要深入開展大樣本的臨床研究加以證實(shí)。

[1] Larmonier N，Janikashvili N，LaCasse CJ，et al．Imatinib mesylate inhibits CD4+CD25+regulatory T cell activity and enhances active immunotherapy against BCR-ABL-tumors[J]．J Immunol，2008，181(10)：6955-6963．

[2] D'Arena G，Rossi G，Minervini MM，et al．Circulating regulatory T cells in “clinical” monoclonal B-cell lymphocytosis[J]．Int J Immunopathol Pharmacol，2011，24(4)：915-923．

[3] Husl I，Tabarkiewicz J，Lewandowska M，et al．Evaluation of monocyte-derived dendritic cells，T regulatory and Th17 cells in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors[J]． Folia Histochem Cytobiol，2011，49(1)：153-160．

[4] Fujimoto S，Greene M，Sehon AH．Immunosuppressor T cells in tumor bearing hosts[J]．Immunol Commun，1975，4(3)：201-217．

[5] Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et a1．Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25)．Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J]．Immunol，1995，155(3)：1151-1164．

[6] Moon HW，Kim BH，Park CM，et al．CD4+CD25 high Foxp3+regulatory T-cells in hematologic diseases[J]． Korean J Lab Med，2011，31(4)：231-237．

[7] Tsai BY，Suen JL，Chiang BL．Lentiviral-mediated Foxp3 RNAi suppresses tumor growth of regulatory T cell-like leukemia in a murine tumor model[J]．Gene Ther，2010，17(8)：972-979．

[8] Jarnicki AG，Lysaght J，Todryk S，et al．Suppression of antitumor immunity by IL-10 and TGF-6-producing T cells infiltrating the growing tumor：influence of tumor environment on the induction of CD4+and CD8+regulatory T cells[J]．J Immunol，2006，177(2)：896-904．

[9] Marshall NA，Christie LE，Munro LR，et al．Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma[J]．Blood，2004，103(5)：1755-1762．