PEDF與VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用

閆喜秋，盧北燕

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江佳木斯154003)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥，endometriosis，EMT)是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體肌層以外的其他部位。內(nèi)異癥的發(fā)病原因很多，如經(jīng)血逆流學(xué)說，遺傳學(xué)說，異位子宮內(nèi)膜局部雌激素分泌增多［1］等。EMT雖是一種良性疾病，但卻表現(xiàn)出與惡性腫瘤相似的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的非典型性增生、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、新生血管形成及遺傳的不穩(wěn)定性等。近年研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能夠直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致新生血管生成，且它的表達(dá)受卵巢分泌的雌激素調(diào)控而呈周期性變化，在分泌晚期達(dá)高峰。因此很多研究也表明，內(nèi)異癥的治療在抗血管治療的方向取得了突破，異位病灶的新生血管被抑制了，同時(shí)也抑制了異位病灶的生長(zhǎng)，從而達(dá)到治療的目的。其中色素上皮衍生因子作為最新發(fā)現(xiàn)的、天然的、最強(qiáng)的血管生成抑制劑，在抑制新生血管生成方面發(fā)揮著重要的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者腹腔液和血液中PEDF蛋白表達(dá)較低，且和內(nèi)異癥的臨床分期相。PEDF還具有一個(gè)特點(diǎn)：可以抑制細(xì)胞移行，呈現(xiàn)劑量依賴性，更重要的是PEDF不損傷已有的血管的內(nèi)皮細(xì)胞，提示PEDF可能在內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。VEGF與PEDF可以看做，是兩類重要的血管生成調(diào)節(jié)因子。本研究采用，免疫組化法檢測(cè)組織中的VEGF與PEDF蛋白表達(dá)，以探討二者在EMT形成過程中的相互作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

(1)研究組：選擇34例EMT病人作為研究組，從2013-01-01～2014-01-01，在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科經(jīng)腹或腹腔鏡手術(shù)，同時(shí)術(shù)后病理確診為子宮內(nèi)膜異位癥，腹腔鏡手術(shù)者可以通過刮宮取得異位內(nèi)膜(排除同時(shí)合并子宮腺肌癥和子宮肌瘤、且年齡35～40歲，子宮次全切及子宮全切除者可直接取得在位內(nèi)膜，病理確定子宮內(nèi)膜期別，增生期14例，分泌期20例，均為初治患者。根據(jù)1987年修正后的美國(guó)生育學(xué)會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)：I～I(xiàn)I期16例，III～I(xiàn)V期18例。

(2)對(duì)照組：34例同期非內(nèi)膜疾病(子宮肌瘤或行絕育術(shù)患者等良性病變)作為對(duì)照組，行子宮全切術(shù)或子宮次全切術(shù)。而且均排除患有內(nèi)異癥者，年齡35～40歲，病理確定為正常子宮內(nèi)膜，增生期16例，分泌期18例。

所有患者月經(jīng)規(guī)律，無放置宮內(nèi)節(jié)育器無內(nèi)分泌免疫及代謝性或炎癥性疾病史，手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受過激素治療，6個(gè)月內(nèi)無哺乳妊娠史。而且患者知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF單克隆抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗人PEDF多克隆抗體購(gòu)自Abcom公司。

1.3 免疫組織化染色

術(shù)中收集新鮮標(biāo)本組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋。切片機(jī)連續(xù)切片，厚度均為5μm，備用。檢測(cè)VEGF與PEDF在各組研究對(duì)象中的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用χ2檢驗(yàn)用于兩兩組數(shù)據(jù)比較。

2 結(jié)果

2.1 VEGF在研究組及對(duì)照組中的蛋白表達(dá)

研究組EMT在位內(nèi)膜陽(yáng)性率高于異位內(nèi)膜陽(yáng)性率(χ2=4.19，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，同時(shí)也高于對(duì)照組正常內(nèi)膜陽(yáng)性率(χ2=11.57，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。見表1。

表1 VEGF在EMT及對(duì)照組內(nèi)膜中的表達(dá)

2.2 PEDF在研究組及對(duì)照組中的蛋白表達(dá)

研究組EMT在位內(nèi)膜陽(yáng)性率低于異位內(nèi)膜陽(yáng)性率(χ2=4.66，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，但高于對(duì)照組正常內(nèi)膜陽(yáng)性率(χ2=4.66，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。見表2。

表2 PEDF在EMT及對(duì)照組內(nèi)膜中的表達(dá)

2.3 Ⅰ、Ⅱ期患者與Ⅲ、Ⅳ期患者組織中VEGF水平

研究組III期、IV期患者組織中VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率高于I期、II期，說明在子宮內(nèi)膜異位癥患者組織中VEGF的表達(dá)水平隨疾病嚴(yán)重程度的加重而升高，差異不顯著。見表3。

表3 I、II期患者與III、IV期患者組織中VEGF水平

2.4 Ⅰ、Ⅱ期患者與Ⅲ、Ⅳ期患者組織中PEDF水平

研究組III期、IV期患者組織中PEDF的表達(dá)陽(yáng)性率高于I期、II期，說明在子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床表現(xiàn)越重，組織中PEDF的表達(dá)水平越高，差異顯著。見表4。

表4 I、II期患者與III、IV期患者組織中PEDF水平

3 討論

3.1 VEGF的表達(dá)及在異位病灶形成中作用

本研究發(fā)現(xiàn)：EMT患者在對(duì)照組內(nèi)膜中VEGF的表達(dá)低于在位內(nèi)膜，因此提示EMT患者在位內(nèi)膜，可能存在異常的生物活性，導(dǎo)致了較強(qiáng)的血管生成能力及血管增殖活性。目前認(rèn)為VEGF促進(jìn)血管形成機(jī)制可能有以下三方面：一方面：EMT患者的正常子宮內(nèi)膜，可隨經(jīng)血逆行流入腹腔，可在卵巢或腹腔其它部位形成早期微小內(nèi)異癥病灶，月經(jīng)周期使異位病灶周期性生長(zhǎng)，由于新生血管基底膜缺損導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層的血液供應(yīng)缺乏，造成異位病灶組織相對(duì)缺氧。缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生缺氧誘導(dǎo)因子，而且VEGF是重要的靶基因，缺氧在基因水平可直接上調(diào)VEGF的表達(dá)，新生血管就這樣形成了。但是新生的血管結(jié)構(gòu)不完整，容易易發(fā)生滲漏和出血，形成典型的異位病灶，大概需要6～24個(gè)月。然而新生的血管不能改善異位組織的缺氧狀態(tài)，反而誘發(fā)更多的血管生成因子，導(dǎo)致大量新生血管的形成，最后導(dǎo)致內(nèi)異癥進(jìn)一步的發(fā)展，病情更加嚴(yán)重。雖然異位內(nèi)膜的不斷生長(zhǎng)，但是新生血管內(nèi)血液的相對(duì)不足，異位內(nèi)膜組織內(nèi)皮細(xì)胞的進(jìn)一步缺氧，而缺氧又促進(jìn)VEGF進(jìn)一步的高表達(dá)，往復(fù)循環(huán)，致使異位內(nèi)膜具有了惡性腫瘤強(qiáng)侵襲性，最后導(dǎo)致輸卵管黏連等一系列的并發(fā)癥。另一方面：VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞快速生長(zhǎng)，使其參與血管的形成。第三方面：VEGF可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs等多種組織因子及組織蛋白酶，這些因子和酶都可以降解內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)和削弱內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的屏障作用，使新生血管基底膜缺損加重，缺氧加重，而異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)又可表達(dá)更多的VEGF，進(jìn)一步促進(jìn)新血管的生成，導(dǎo)致了惡性循環(huán)。

研究結(jié)果還顯示：研究組異位內(nèi)膜和對(duì)照組均低于在位內(nèi)膜組織中VEGF的表達(dá)而且異位內(nèi)膜組又高于對(duì)照組，說明在位內(nèi)膜可時(shí)異位內(nèi)膜獲得相對(duì)充分的血液供應(yīng)，使異位內(nèi)膜得到快速的生長(zhǎng)，這就表明在位內(nèi)膜可能具有超強(qiáng)的血管生成活性。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜的血管生成力比在位內(nèi)膜明顯減低，原因可能是在位內(nèi)膜對(duì)異位內(nèi)膜有一定的抑制作用，尚有待進(jìn)一步研究。增生期的在位內(nèi)膜VEGF的表達(dá)低于分泌期，說明內(nèi)膜在分泌期具有更強(qiáng)的促血管生產(chǎn)能力及較強(qiáng)的侵襲活性。也說明激素可能影響VEGF的表達(dá)。VEGF在r-AFS臨床分期中，Ⅰ、Ⅱ期的表達(dá)陽(yáng)性率為83.33%，Ⅲ、Ⅳ期的強(qiáng)度表達(dá)陽(yáng)性率為93.75%，差異不大，說明VEGF與內(nèi)異癥的臨床分期無顯著關(guān)系，與內(nèi)異癥的病情嚴(yán)重程度關(guān)系不大。

3.2 PEDF在EMT的中表達(dá)及在EMT發(fā)生發(fā)展中的作用

色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是1989年Tombran Tink［2］等從胎兒色素上皮培養(yǎng)液中，其分子量為50Kd，位于常染色體17p13.1［3］上。1999年Daw son［4］等通過實(shí)驗(yàn)研究，第一次發(fā)現(xiàn)PEDF還具有很強(qiáng)的抑制血管生成的作用，而且比以往發(fā)現(xiàn)的抑制血管生成的因子(如內(nèi)皮抑素等)還要強(qiáng)。目前，認(rèn)為PEDF抑制新血管形成的機(jī)制有如下幾種可能：(1)在缺氧下，各種血管生成誘導(dǎo)因子大量表達(dá)，此時(shí)PEDF能有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞向各種血管生成誘導(dǎo)劑(如溶血磷脂酸，白細(xì)胞介素 -8，PDGF，VEGF，a-FGF)移行。(2)PEDF可以促進(jìn)JNK的磷酸化，血管生成基因介導(dǎo)的T細(xì)胞核因子的激活被阻止。另外不同的磷酸化位點(diǎn)，可以使PEDF發(fā)揮抗血管生成的作用，如阻止Ser24及Ser114的磷酸化，可以去除PEDF的營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)功能，同時(shí)會(huì)加強(qiáng)其抗新生血管生成功能。某些研究表明：采用尾靜脈主神注射脂納米載體介導(dǎo)的PEDF于子宮內(nèi)膜異位癥鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：PEDF對(duì)照組的異位病灶大小明顯高于治療組(P＜0.05)，同時(shí)治療組的組織形態(tài)學(xué)出現(xiàn)明顯的萎縮跡象；PEDF對(duì)照組間質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)顯著高于治療組(P＜0.05)；PEDF對(duì)照組異位病灶凋亡指數(shù)顯著低于治療組(P＜0.05)，結(jié)果證實(shí)PEDF抑制新生血管生成或促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示：PEDF在異位內(nèi)膜的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于在位內(nèi)膜；正常對(duì)照組內(nèi)膜低于在位內(nèi)膜的陽(yáng)性表達(dá)率，表明PEDF抑制新生血管生成或促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。研究組增生期的在位內(nèi)膜PEDF的表達(dá)與分泌期內(nèi)膜無顯著差異。內(nèi)異癥臨床r-AFS分期，PEDF在III-IV期高于I-II期患者，說明與內(nèi)異癥的病情嚴(yán)重程度有關(guān)系。

3.3 PEDF與VEGF相關(guān)性和在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的意義

Stellmach［5］等認(rèn)為，PEDF可能通過促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，來抑制血管生成的。另外，Volpert［6］等研究還認(rèn)為，PEDF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的這種作用是通過FasL-Fas受體系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。Fas是一種跨膜受體，F(xiàn)asL是一種跨膜蛋白，當(dāng)FasL激活Fas時(shí)即可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，PEDF還可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞FasL的表達(dá)。VEGF產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞與PEDF有很大的不同，此內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Fas受體易受PEDF作用，因此PEDF上調(diào)FasL、Fas與FasL［8］相互作用引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［7］。此外還有學(xué)者研究認(rèn)為，PEDF是通過VEGF的移行，來實(shí)現(xiàn)抑制血管的增生作用。

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