補腎活血法與益氣補血法對環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制小鼠骨髓基質細胞生長及血清IL-6的影響

陳慧彬，王 茜，竇永起

(解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

化療是治療惡性腫瘤最重要的手段之一，骨髓抑制是其主要毒副作用，中醫(yī)最常用益氣補血中藥進行治療，但療效并并不令人滿意。筆者多年的臨床實踐體會到補腎活血法亦可以提高其防治效果。實驗研究表明，兩法均可減輕化療后骨髓抑制，促進造血功能的恢復，但有一定差異；兩法在某些作用途徑和環(huán)節(jié)上既有差異，又有協(xié)同[1]。骨髓基質細胞是造血微環(huán)境中的重要組成成分，對造血細胞具有黏附滋養(yǎng)作用，通過分泌細胞因子及其他活性物質對造血干、祖細胞的增殖、分化和生長起重要調控作用。血清白介素-6(IL-6)與造血系統(tǒng)疾病相關，骨髓造血障礙會導致患者血清IL-6分泌增多[2]，同時環(huán)磷酰胺(CTX)亦可導致骨髓基質細胞分泌IL-6增多[3]。為了進一步了解兩種方法作用機制的差異與協(xié)同價值，本研究比較了兩種方法對血清IL-6及骨髓基質細胞的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級ICR小鼠80只，雌雄各半，6～8周齡，體質量18～22 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(軍)2007-004，設施合格證號：SYXK(軍)2007-004。

1.1.2試劑與儀器 IL-6ELISA試劑盒，全自動多功能酶標儀，微量反應板自動洗板機，自動降溫/恒溫循環(huán)儀，低溫離心機，光學顯微鏡數(shù)碼照相系統(tǒng)，恒溫水浴鍋，干燥箱，高壓滅菌鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.1.3藥物及制備 補腎活血方由熟地黃、枸杞子、川芎、丹參等組成， 益氣補血方由黃芪、當歸、黨參、雞血藤等組成。以上藥物均由解放軍總醫(yī)院中藥房提供，經鑒定后，水煎、過濾，60 ℃濃縮，配制成含生藥1 g/mL的藥液，置4 ℃保存?zhèn)溆?。注射用CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產。

1.2方法

1.2.1模型的制作 參照文獻[4]方法，CTX溶液100 mg/(kg·d)，腹腔注射1次/d,連續(xù)3 d。

1.2.2動物分組及給藥 動物隨機分為5組：對照組、模型組、益氣補血組、補腎活血組、補腎活血加益氣補血(中藥聯(lián)合)組，每組16只。參照文獻[4]，計算小鼠的等效劑量，補腎活血組17.47 g/(kg·d)、益氣補血組17.47 g/(kg·d)、中藥聯(lián)合組20.55 g/(kg·d)，連續(xù)灌胃給藥至實驗結束；對照組和模型組分別給予等體積的蒸餾水。給藥第8天開始，除對照組外，其余4組小鼠均于給藥第8天給予腹腔注射CTX溶液100 mg/(kg·d)，連續(xù)3 d。

1.3指標檢測

1.3.1血清IL-6含量檢測 采用雙抗體夾心ELISA法檢測。造模后3 d及造模后7 d各選取8只小鼠股骨動脈取血處死,離心,取上清。檢測方法參照試劑盒說明書，將標準品的稀釋與加樣，封板、溫育，將濃縮洗滌液稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加洗滌液，靜置后棄去，如此重復5次，拍干，每孔加入酶標試劑，空白孔除外，再溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑，震蕩混勻，避光顯色后每孔加終止液終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白空調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。IL-6濃度與OD450值呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-6濃度。

1.3.2骨髓基質細胞培養(yǎng) 分別在開始造模的第3天、第7天24 h后，頸椎脫臼處死各組8只小鼠，用75%乙醇浸泡，無菌超凈臺條件下取出股骨，用6號針頭以DMEM培養(yǎng)基反復多次沖出骨髓細胞，再換4號針頭抽打過濾制成單個骨髓細胞懸液，充分混勻同組單細胞懸液，將骨髓抑制小鼠有核細胞1×109L-1接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每組重復接種6孔，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，3 d后半量換液，培養(yǎng)7 d及14 d后，觀察骨髓基質細胞生長情況，并用二乙酸熒光素染色后照相。

2 結 果

2.1各組小鼠血清IL-6水平比較 造模后第3天，模型組及中藥組小鼠血清中的IL-6水平較對照組均明顯升高(P均<0.01)，且3個藥物組明顯低于模型組，尤以中藥聯(lián)合組明顯，補腎活血組次之(P<0.05)。造模后第7天，模型組與各藥物組IL-6水平均明顯下降(P均<0.01)，其中模型組IL-6水平最高，補腎活血組次之，中藥聯(lián)合組最接近對照組(P>0.05)。見表1。

2.2各組骨髓基質細胞生長比較 開始造模后3 d取骨髓基質細胞培養(yǎng)14 d，模型組貼壁細胞數(shù)量減少，梭形成纖維細胞比例降低，大多數(shù)細胞胞核不清楚，一些胞體模糊的變性退變細胞光鏡下可見，細胞融合差；而各中藥組骨髓基質細胞較模型組增殖活性明顯，呈平行樣或漩渦狀生長，且能形成少量集落，熒光染色后示細胞融合性好。造模后第7天取各組骨髓基質細胞經培養(yǎng)14d后貼壁細胞數(shù)量及成纖維細胞集落與對照組比較無明顯差異。見圖1及圖2。

表1 對外周血細胞因子IL-6的影響比較

注:①與對照組比較，P<0.01;②與模型組比較，P<0.01；③與造模后3 d組比較，P<0.01；④與對照組比較，P>0.05。

3 討 論

IL-6是一種具有廣泛造血及免疫調節(jié)作用的細胞因子，可由骨髓基質細胞中成纖維細胞、成骨細胞等分泌，能促使多能干細胞進入細胞周期，促使骨髓中紅系和粒系的增生，增加外周血中性粒細胞、紅細胞和血小板數(shù)目。IL-6與其他細胞因子一樣， 不僅在局部起作用，而且在特定狀態(tài)下可以大量分泌進入血液循環(huán)。有報道放化療致骨髓抑制小鼠骨髓基質細胞培養(yǎng)上清液中IL-6表達水平顯著高于正常組，顯示射線及化療藥物會引起骨髓基質細胞IL-6分泌增多[5]。實驗中的造模藥物CTX屬烷化劑[6]，呈非細胞周期特異性的細胞毒性作用，在殺傷迅速增殖的腫瘤細胞同時，也損傷了多數(shù)處于增殖周期的定向干細胞，在急性應激期內，造血功能低下，機體會代償性分泌IL-6以促進骨髓腔內殘留的原始干細胞增殖、分化，進而進入外周循環(huán)池，以恢復處周血細胞水平。本實驗中，造模后小鼠血清造血細胞生長因子IL-6表達水平均高于對照組。

圖1 造模后第 3 天各組小鼠骨髓基質細胞(熒光染色，×200)

圖2 造模后第 7天各組小鼠骨髓基質細胞(熒光染色，×200)

BMSC來源于骨髓間充質干細胞，是支持造血實質細胞生存的造血微環(huán)境中的一部分，其黏附結構調節(jié)造血干、祖細胞回髓定位，并通過分泌細胞因子IL-6等調控造血。本實驗中模型組造模后基質細胞受到嚴重損傷，與CTX損傷骨髓基質細胞前體間充質干細胞有關。有文獻報道，高水平的IL-6會導致骨髓基質細胞的凋亡[7]。骨髓抑制小鼠造血功能低下，機體代償性異常分泌IL-6，高表達的IL-6又刺激了腫瘤壞死因子TNF的產生，而TNF量的提升又反過來刺激了IL-6的進一步分泌，從而加強了負向調控造血作用，且高水平表達的IL-6參與了骨髓基質細胞的凋亡。李楠等[8]在觀察IL-6對體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質細胞凋亡的影響時，發(fā)現(xiàn)IL-6高表達可使大量細胞停留在G1期，阻滯細胞進入S期，使DNA合成受阻；IL-6高表達還使細胞的Baxm RNA表達、凋亡率和線粒體膜電位改變增高，Bcl-2 mRNA表達呈下降趨勢，促進Bax從胞漿中移至線粒體膜上而使Bax在與Bcl-2形成的異二聚體中占據(jù)優(yōu)勢來促進線粒體上的PT孔道開放，使內膜離子通道改變，線粒體內膜電位下降或喪失，導致Cystic等蛋白的釋放，從而調節(jié)細胞凋亡，促進骨髓基質細胞的凋亡。因此，IL-6對造血呈現(xiàn)雙向調節(jié)的量效作用。

本實驗結果表明，經中藥治療后IL-6的表達水平較模型組明顯下降，說明補腎活血方和益氣補血方對高水平 IL-6 均具有明顯的下調作用，益氣補血法的調節(jié)作用優(yōu)于補腎活血法，兩法聯(lián)用調節(jié)效果更佳，且各中藥組骨髓基質細胞較模型組增殖活性明顯，說明3個中藥組均可以防治化療導致的骨髓造血功能損傷，促進造血功能的恢復，補腎活血方和益氣補血方聯(lián)合運用可以增強其對造血因子的調控。

化療藥引起骨髓抑制在中醫(yī)常屬“虛勞”、“血虛”范圍，治療以扶正為主，以補氣養(yǎng)血為原則，補腎活血，益氣健脾生血。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為，腎主骨生髓藏精，精血同源，精血互生；脾為后天之本、氣血生化之源。益氣補血方為當歸補血湯加減化裁，重用黃芪大補脾肺之氣，以裕生血之源;更用當歸益血和營，以使陽生陰長，氣旺血生；黨參能補養(yǎng)中氣，調和脾胃；白芍養(yǎng)血斂陰，不惟治血虛，大能行氣；雞血藤能去瘀血，生新血，流利經脈。補腎活血方中熟地補血養(yǎng)陰，填精益髓，虛損血衰之人須用之；何首烏能養(yǎng)血益肝，固精益腎；枸杞子味甘多液，為滋補肝腎最良之藥；川芎能破結宿血，養(yǎng)新血；丹參祛瘀、活血養(yǎng)血通經。兩方合用，能補腎、益氣、活血，療效更佳。

[參考文獻]

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