槲皮素聯(lián)合白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株HL-60-ADM耐藥性的影響

張復(fù)華* 尹松梅* 牛國(guó)敏 楊國(guó)雷 凌奕文 李 蕊 徐嘉愉

（1 南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東 佛山 528200；2 中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

急性白血病是血液系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性疾病，聯(lián)合化療是治療急性白血病的主要手段，但仍有部分患者不能緩解或緩解后很快復(fù)發(fā)[1]。白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是化療失敗的主要原因，尋找高效低毒的白血病耐藥逆轉(zhuǎn)藥物是目前研究的重點(diǎn)[2]。槲皮素是自然界分布最廣泛的黃酮類(lèi)化合物，本研究前期發(fā)現(xiàn)槲皮素（Quercetin，Que）通過(guò)抑制Cox-2的表達(dá)降低Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)Bax的表達(dá)，啟動(dòng)Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡[3]。研究提示槲皮素是有效的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑，可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是從葡萄植物屬中提取的多酚類(lèi)化合物，有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促凋亡等作用。本研究將Que、Res兩種低毒性的植物提取物用于急性髓系白血病耐藥細(xì)胞株HL-60-A的研究，觀察藥物單用、聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及逆轉(zhuǎn)耐藥等影響，探討Que及Res逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料：槲皮素（sigma，美國(guó)），白藜蘆醇（sigma，美國(guó)）用DMSO溶解，阿霉素（adriamycin，ADM）（深圳萬(wàn)樂(lè)公司，中國(guó)）用生理鹽水溶解，制成母液后-20 ℃保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：HL-60、HL-60-A細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，HL-60-A為ADM誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞株建立的耐藥細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。復(fù)蘇細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（杭州四季青 中國(guó)）、3%谷氨酰胺的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)Que、Res的細(xì)胞毒性作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60、HL-60-A細(xì)胞，計(jì)數(shù)并接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞5×104個(gè)。不同濃度Que、Res單用或聯(lián)用（濃度梯度設(shè)為0、12.5、25、50、75、100、150μmol/L）加入細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，設(shè)空白孔，陰性對(duì)照組，每孔液體終體積200μL，培養(yǎng)48 h后加入37 ℃預(yù)熱的CCK-8(同仁化學(xué)研究所，日本)，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，參照波長(zhǎng)為630 nm，測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果，取3個(gè)復(fù)孔的平均吸光度值作為該濃度條件下的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。以藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸，抑制率為縱軸繪制濃度-效應(yīng)曲線，根據(jù)線性回歸方程求出半數(shù)抑制率（IC50）。

1.4 CCK-8法檢測(cè)Que、Res單用或聯(lián)用對(duì)耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60-A細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入Que、Res與不同濃度ADM（濃度梯度為0 2.5 5 10μg/mL）孵育，實(shí)驗(yàn)分組如下：①對(duì)照組；②Que 12.5 μmol/L+ADM；③Res 12.5μmol/L+ADM；④Que 6.25μmol/L+ Res 6.25 μmol/L+ADM；⑤Que 25μmol/L+ADM；⑥Res 25μmol/L+ADM；⑦Que 12.5μmol/L+ Res 12.5μmol/L+ADM，余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)驗(yàn)方法1.3。耐藥指數(shù)（Resistance index，RI）=IC50（耐藥細(xì)胞）/IC50（親本細(xì)胞）；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（Reversal fold，RF）=IC50（逆轉(zhuǎn)前）/IC50（逆轉(zhuǎn)后）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法：數(shù)據(jù)描述使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；多組資料間均數(shù)的比較用方差分析。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 ADM對(duì)HL-60-A細(xì)胞耐藥性的分析

不同濃度的ADM（濃度梯度為 0.025、0.05、0.1、0.2、1.25、2.5、5、10 μg/mL）與HL-60及HL-60-A共培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)ADM的耐受性，結(jié)果顯示，ADM對(duì)HL-60及HL-60-A的IC50值分別為（0.042±0.002）、（5.124±0.004）μg/mL，RI為122，提示HL-60-A細(xì)胞為耐藥細(xì)胞株。

2.2 Que、Res單用及聯(lián)用對(duì)HL-60-A細(xì)胞毒性的影響

不同濃度的Que、Res分別與HL-60-A共培養(yǎng)48 h檢測(cè)細(xì)胞存活率，Que、Res對(duì)HL-60-A的IC50值分別為（74.74±9.27）、（100.57±4.66）μmol/L，提示單獨(dú)使用Que、Res均可抑制HL-60-A生長(zhǎng)，其細(xì)胞毒性作用呈劑量依賴(lài)性；Que+Res 對(duì)HL-60-A的IC50為（54.84±6.29）μmol/L，提示聯(lián)合使用Que+Res可進(jìn)一步殺傷白血病細(xì)胞（圖1）。

圖1

2.3 Que、Res單用及聯(lián)用對(duì)HL-60-A細(xì)胞耐藥性的影響

根據(jù)Que、Res對(duì)HL-60-A細(xì)胞毒性作用可見(jiàn)，Que、Res濃度為12.5及25μmol/L時(shí)毒性弱，選用此2種濃度作為逆轉(zhuǎn)耐藥濃度分別與ADM孵育。方差分析結(jié)果顯示，Que 12.5μmol/L、Res 12.5μmol/L、Que 6.25μmol/L+Res 6.25 μmol/L與不同濃度ADM孵育后細(xì)胞存活率差別有意義（P＜0.05），Que 25μmol/L、Res 25μmol/L、Que 12.5μmol/L+Res 12.5 μmol/L組間差別亦有意義（P＜0.05）；Que、Res單獨(dú)使用12.5 μmol/L時(shí)ADM的IC50值分別（3.59±0.04）、（3.97±0.02）μg/mL；RF為 1.54倍和1.40倍；劑量25μmol/L時(shí)IC50值分別（2.45±0.02）、（3.63±0.01）μg/mL，RF為 2.26倍和1.52倍，提示小劑量Que或Res即可增強(qiáng)ADM對(duì)HL-60-A的殺傷作用，Que增敏作用更明顯；Que、Res聯(lián)合使用時(shí)IC50值分別（2.98±0.02）、（1.97±0.01）μg/mL，RF為 1.86倍和2.81倍，較Que、Res單用RF明顯下降，表明聯(lián)合使用Que、Res可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)HL-60-A耐藥的作用。

3 討論

作為黃酮類(lèi)化合物中最常見(jiàn)及應(yīng)用范圍最廣的Que目前認(rèn)為其有抗氧化、抗過(guò)敏、抗血栓、抗血小板聚集和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性及藥理作用，且對(duì)白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一[4,5]。本研究發(fā)現(xiàn)Que不僅可以殺傷白血病細(xì)胞，對(duì)白血病耐藥細(xì)胞亦有一定的殺傷作用，低劑量時(shí)即可以明顯增強(qiáng)ADM對(duì)HL-60-A的敏感性，與蔡迅等[6]研究結(jié)果大致一致。本結(jié)果同時(shí)提示Que是低毒性物質(zhì)，單用對(duì)HL-60-A的殺傷及逆轉(zhuǎn)耐藥效果均有限，可通過(guò)聯(lián)用低毒性藥物增強(qiáng)其抗腫瘤作用。Res作為葡萄屬提取物是一種安全的藥物，亦有一定的抗腫瘤作用[7]，本研究用其聯(lián)合Que進(jìn)一步研究抗腫瘤作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Res有一定的抗白血病作用，但較Que弱。低劑量Que+Res（6.25或12.5μmol/L）對(duì)HL-60-A的RF明顯比單用Que或Res（12.5或25μmol/L）高，提示聯(lián)合使用Que和Res可提高逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥性，其作用機(jī)制可能與其加強(qiáng)抑制細(xì)胞膜上MRP泵功能，減少耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物外流有關(guān)[8]，本研究將進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為Que、Res應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

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