西瓜TALE基因家族鑒定及表達(dá)分析

摘 要：TALE基因家族在調(diào)控花器官發(fā)育、花分生組織形成、器官形態(tài)發(fā)生、果實(shí)發(fā)育、植物非生物脅迫響應(yīng)及激素響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。利用生物信息學(xué)的方法鑒定了西瓜 TALE基因家族成員，并分析了其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹、保守基序、順式作用元件、組織特異性表達(dá)，以及低溫脅迫和干旱脅迫后基因的表達(dá)情況，為西瓜TALE基因家族的功能研究和利用提供了理論依據(jù)。結(jié)果表明，西瓜TALE基因家族共包含19個(gè)成員。系統(tǒng)發(fā)育分析將ClTALE家族分為BEL1-like和KNOX兩個(gè)亞家族，KNOX亞家族又可進(jìn)一步劃分為兩個(gè)分支Class I和Class II。順式作用元件分析表明，ClTALE基因的啟動(dòng)子中富含光、植物激素和非生物脅迫響應(yīng)的順式元件，其中光響應(yīng)元件最多。西瓜組織特異性表達(dá)分析表明，ClBLH09在根中高表達(dá)，ClBLH01在卷須、雌花和雄花中高表達(dá)，因此西瓜TALE基因家族可能參與了西瓜的生長(zhǎng)發(fā)育過程。低溫脅迫（0、3、6、12、24、36和48 h）和干旱脅迫（0、1、2、3、4、5、6、7和8 d）不同時(shí)間后基因的表達(dá)分析表明，ClBLH08和ClKN02在低溫脅迫下呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，ClBLH04和ClBLH05在干旱脅迫下呈上調(diào)的趨勢(shì)，因此西瓜TALE基因家族可能在低溫脅迫和干旱脅迫中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 西瓜；TALE基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）10-018-12

收稿日期：2024-02-21；修回日期：2024-08-13

基金項(xiàng)目：西北農(nóng)林科技大學(xué)種業(yè)創(chuàng)新專項(xiàng)（2452022116）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-25）；楊凌種業(yè)創(chuàng)新中心重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（Ylzy-sc-01）

作者簡(jiǎn)介：陳筱瑤，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟擞N與生物技術(shù)。E-mail：1173538169@qq.com

通信作者：霍治邦，男，研究員，研究方向?yàn)槲鞴嫌N。E-mail：huozhibang@163.com

魏春華，男，副教授，研究方向?yàn)槭卟擞N與生物技術(shù)。E-mail：xjwend020405@nwafu.edu.cn

Identification and expression analysis of TALE gene family in watermelon

CHEN Xiaoyao1， FENG Mengjiao1， HUANG Xin1， ZHANG Ruiqing1， DAI Xue1， WANG Jiafa1， ZHANG Xian1， LI Junhua2， HUO Zhibang2， WEI Chunhua1

（1. College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Kaifeng Academy of Agriculture and Forestry， Kaifeng 475004， Henan， China）

Abstract： The TALE gene family plays a pivotal role in regulating various aspects of plant growth and development， including floral organ development， floral meristem formation， organ morphogenesis， and fruit development， as well as mediating plant responses to abiotic stress and hormone signals. This study utilized bioinformatics methods to identify members of the TALE gene family in watermelon and conducted a comprehensive analysis of their gene structure， phylogenetic relationships， conserved motifs， cis-acting elements， tissue-specific expression patterns， and gene expression profiles under low temperature and drought stress conditions. This analysis provides a theoretical foundation for further functional studies and utilization of the TALE gene family in watermelon. The results revealed that the watermelon TALE gene family consists of a total of 19 members. Phylogenetic analysis classified the ClTALE family into two distinct subfamilies： BEL1-like and KNOX， with the KNOX subfamily further subdivided into two classes， Class I and Class II. Cis-acting element analysis demonstrated that the promoters of ClTALE genes are enriched in cis-elements that respond to light， plant hormones， and abiotic stresses， with light-responsive elements being the most prevalent. Tissue-specific expression analysis in watermelon indicated that ClBLH09 is highly expressed in roots， while ClBLH01 exhibits high expression levels in tendrils， female flowers， and male flowers， implying that the watermelon TALE gene family may be involved in the growth and development of watermelon. Gene expression analysis at various time points under low temperature stress（0， 3， 6， 12， 24， 36， and 48 h） and drought stress（0， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， and 8 d） revealed that ClBLH08 and ClKN02 exhibited an upward trend in expression under low temperature stress， while ClBLH04 and ClBLH05 showed an upward trend under drought stress. These findings suggested that the watermelon TALE gene family may play a significant role in mediating responses to low temperature and drought stress.

Key words： Watermelon; TALE gene family; Bioinformatics; Expression analysis

同源異型盒基因是一類在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演重要角色的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。早期研究將植物的同源異型盒基因分為11個(gè)類別，其中包括HD-ZIP、WOX、NDX、PHD、PLINC、LD、DDT、SAWADEE、PINTOX、KNOX和BEL1-like[1]。根據(jù)蛋白序列和進(jìn)化關(guān)系的分析結(jié)果，BELL和KNOX被歸類為TALE基因家族[2-3]。重要的是，KNOX和BEL1-like同源盒結(jié)構(gòu)可以通過3個(gè)額外的氨基酸殘基進(jìn)行環(huán)狀連接，形成了三氨基酸環(huán)延伸（TALE）超級(jí)家族同源盒結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)對(duì)調(diào)控植物多樣化生物過程至關(guān)重要[4-6]。TALE基因家族在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[7-10]、調(diào)控孢子體程序[11]、植物分生組織的形成[2]以及器官形態(tài)[12]、器官位置[13]、激素調(diào)節(jié)[14]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]和塊莖形成的維持[16]等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，BEL1-like蛋白和KNOX蛋白是兩類參與植物發(fā)育的關(guān)鍵蛋白，BELL和KNOX蛋白質(zhì)可以特異性地相互識(shí)別并結(jié)合形成BELL-KNOX異源二聚體[17]，這對(duì)兩種轉(zhuǎn)錄因子蛋白的核定位和結(jié)合靶基因的活性至關(guān)重要[18-19]。BEL1-like蛋白質(zhì)含有1個(gè)稱為Homeodomain（也稱為Homeobox）的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與Homeobox_KN結(jié)構(gòu)域共享序列。此外，它還包含1個(gè)由SKY和BEL1區(qū)域組成的POX結(jié)構(gòu)域（也稱為MID）。BELL在胚珠發(fā)育、葉片發(fā)育和果實(shí)發(fā)育中起重要作用[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，BELL蛋白ATH1會(huì)對(duì)開花位點(diǎn)C（FLC）的表達(dá)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致花朵生成受阻[22]。相反地，BLH3和BLH6則被識(shí)別為花朵發(fā)育的促進(jìn)因子。當(dāng)BLH6的表達(dá)水平升高時(shí)，花朵的開放時(shí)間會(huì)推遲，而當(dāng)BLH3的表達(dá)水平升高時(shí)，花朵的開放時(shí)間則會(huì)提前[23]。此外，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，PNY和ATH1之間的相互影響對(duì)開花產(chǎn)生一定的抑制作用，而PNF和ATH1之間的相互影響則呈現(xiàn)相反的效果[24]。KNOX基因家族包括KNOX1、KNOX2、ELK和同源域，除了1個(gè)不含同源域的基因KNATM[25-26]。其中，KNOX1和KNOX2是MEINOX結(jié)構(gòu)域的2個(gè)子域，而MEINOX結(jié)構(gòu)域則是介導(dǎo)KNOX或BEL1-like蛋白與其他蛋白相互作用的關(guān)鍵。研究表明，KNOX1在分生組織的發(fā)育和維持中具有重要作用；而KNOX2則參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁的次生生長(zhǎng)，對(duì)根、莖、種皮和心材的發(fā)育具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[27-30]。

TALE基因家族不僅在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，而且在植物脅迫中也起作用。例如，GmBHL4蛋白與gmshbh1蛋白異源二聚體，調(diào)控大豆對(duì)干旱、高溫和濕度脅迫的響應(yīng)[31]。后來對(duì)大豆TALE基因家族的研究表明，TALE基因可能在應(yīng)對(duì)非生物脅迫中發(fā)揮作用，并有助于大豆抗鹽和脫水脅迫的遺傳改良[32]。楊樹35個(gè)TALE基因中，約有1/3的基因響應(yīng)鹽脅迫[33]。小麥TALE基因家族中的 TaKNOX11-A 增強(qiáng)了擬南芥的耐旱性和耐鹽性。TaKNOX11-A 過表達(dá)的植物丙二醛含量降低，脯氨酸含量增加，使植物更好地適應(yīng)不利環(huán)境[34]。

筆者利用西瓜種質(zhì)M08（果皮有清晰條紋的品種）研究TALE基因在西瓜中的功能和調(diào)控機(jī)制，有助于調(diào)控西瓜的生長(zhǎng)模式和花果發(fā)育。西瓜基因組數(shù)據(jù)的完成為西瓜基因功能的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持。筆者對(duì)西瓜TALE基因家族進(jìn)行了全面鑒定，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體定位、順式作用元件和基因組織表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)分析。通過對(duì)ClTALE的系統(tǒng)鑒定，為未來基因功能研究奠定基礎(chǔ)，并促進(jìn)其在干旱和低溫脅迫下西瓜遺傳改良中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料西瓜種質(zhì)M08由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院瓜類種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良實(shí)驗(yàn)室收集保存，性狀穩(wěn)定遺傳。試驗(yàn)于2022年11月至2023年12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院瓜類種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

取籽粒飽滿的西瓜種質(zhì)M08種子，55～60 ℃溫湯浸種催芽后播種于50孔穴盤中，放置在人工氣候箱（28 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度70%）內(nèi)。于3葉1心時(shí)定植在溫室大棚中，并合理實(shí)施澆水及病蟲害防治等栽培管理措施，開花期嚴(yán)格自交授粉。授粉后26 d分別取根、莖、葉、卷須、雌花和雄花這6個(gè)組織部位，采用隨機(jī)區(qū)組法取樣，每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)。所有樣品用錫箔紙包裹后放于液氮中速凍，隨后存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。

西瓜種質(zhì)M08植株3葉1心時(shí)在人工氣候箱（4 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對(duì)濕度70%）進(jìn)行低溫脅迫（0、3、6、12、24、36和48 h），取脅迫處理后的真葉葉片組織，采用隨機(jī)區(qū)組法取樣；所有樣品用錫箔紙包裹后放于液氮中速凍，隨后存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。西瓜種質(zhì)M08植株3葉1心時(shí)在培養(yǎng)架上（28 ℃，16 h光照/8 h黑暗）進(jìn)行干旱脅迫處理（0、1、2、3、4、5、6、7和8 d），取脅迫處理后的真葉葉片組織，采用隨機(jī)區(qū)組法取樣。

1.2 西瓜TALE基因家族鑒定

根據(jù)擬南芥[26]TALE基因家族研究結(jié)果，從擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥的TALE蛋白序列；通過TBtools軟件提取最具代表性的ClTALE蛋白序列，獲得的西瓜TALE蛋白序列通過NCBI網(wǎng)站上的在線工具BLASTp（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)一步驗(yàn)證。使用NCBI網(wǎng)站上的在線工具Conserved Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）探索西瓜TALE蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。通過Pfam在線網(wǎng)站 （http：//pfam.xfam.org/）和SMART在線網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）確定候選西瓜TALE蛋白序列是否擁有植物TALE基因家族保守結(jié)構(gòu)域，通過篩選得到西瓜中TALE基因家族的全部蛋白序列。通過利用Expasy網(wǎng)站上提供的在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/），對(duì)西瓜TALE基因家族的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)長(zhǎng)度等信息進(jìn)行分析。

1.3 西瓜TALE基因在染色體上的分布

從葫蘆科數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/v2/）中獲取ClTALEs在染色體上的位置信息，根據(jù)染色體位置進(jìn)行重命名，使用TBtools軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，得到了西瓜TALE基因家族在染色體上的分布情況。

1.4 西瓜TALE基因家族進(jìn)化關(guān)系分析

使用MEGA 7軟件中的Clustal W序列比對(duì)程序，對(duì)西瓜和擬南芥的TALE蛋白序列進(jìn)行了多序列比對(duì)，并利用鄰接法（neighbour-joining， NJ）構(gòu)建了進(jìn)化樹（設(shè)置Bootstrap值為1000，model為P-distance，partial deletion值為50%，其余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)置）。將得到的進(jìn)化樹文件通過Evolview在線網(wǎng)站（https：//evolgenius.info//evolview-v2/）進(jìn)行美化處理。

1.5 西瓜TALE基因家族基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對(duì)西瓜TALE蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，將最大基序檢索值設(shè)置為12，其他參數(shù)使用默認(rèn)值，下載得到了結(jié)果文件meme.xml。利用ClTALEs的gff文件、系統(tǒng)進(jìn)化樹與MEME在線預(yù)測(cè)文件 meme.xml，在 TBtools 軟件上進(jìn)行可視化。利用葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站Batch query工具下載西瓜 TALE蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列和cDNA序列，利用Gene Structure Display Server 2.0 （http：//gsds.gao-lab.org）分析其內(nèi)含子及外顯子并進(jìn)行可視化。

1.6 西瓜TALE基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件分析

利用TBtools提取西瓜TALE基因上游2000 bp序列。然后將提取的序列提交給PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），分析基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件，選取與脅迫及激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，由TBtools繪制西瓜TALE基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件圖。

1.7 西瓜TALE基因表達(dá)分析

在本研究中，西瓜種質(zhì)M08的根、莖、葉、卷須、雌花和雄花這6個(gè)組織分別于授粉后26 d取樣，以這6個(gè)組織提取總RNA，隨后使用FastKing一步法基因組 cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，以管家基因ClACT（cl007792）為內(nèi)參。使用NCBI在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)定量引物（表1），通過qRT-PCR試驗(yàn)獲取西瓜TALE基因在6個(gè)組織中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用Excel標(biāo)準(zhǔn)化處理以上數(shù)據(jù)，基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-??CT法，每個(gè)樣品3次重復(fù)，對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2處理，通過TBtools軟件繪制基因表達(dá)熱圖進(jìn)行聚類分析。在西瓜種質(zhì)M08植株3葉1心時(shí)期進(jìn)行低溫脅迫（0、3、6、12、24、36和48 h）和干旱脅迫（0、1、2、3、4、5、6、7和8 d處理），取脅迫處理后的葉片組織提取 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 模板，通過qRT-PCR試驗(yàn)獲取西瓜TALE基因在低溫脅迫和干旱脅迫中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用Excel標(biāo)準(zhǔn)化處理以上數(shù)據(jù)，基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-??CT法，每個(gè)樣品3次重復(fù)，對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2處理，使用TBtools軟件的Heatmap功能繪制基因表達(dá)的熱圖，并使用TBtools軟件的Show Control Dialog進(jìn)行圖片美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜TALE基因家族成員的鑒定

參照擬南芥TALE基因家族的分類，西瓜TALE基因家族分為BEL1-like和KNOX兩個(gè)亞家族。采用生物信息學(xué)方法對(duì)西瓜TALE基因家族的成員進(jìn)行了鑒定，共鑒定出19個(gè)成員，根據(jù)其在染色體上的排列位置系統(tǒng)命名ClBLH01～ClBLH10、ClKN01～ClKN09（表2）。結(jié)果顯示，ClTALE蛋白的氨基酸數(shù)目在275～921 aa （ClBLH01～ClBLH10、ClKN01～ClKN09） 之間，相對(duì)分子質(zhì)量31.38～103.13 kD（ClBLH01～ClBLH10、ClKN01～ClKN09）之間，除ClBLH03、ClBLH09和ClKN01的蛋白等電點(diǎn)大于7，其余ClTALE 蛋白等電點(diǎn)均在5.03～6.93之間，所有ClTALE蛋白疏水性都小于0。研究發(fā)現(xiàn)，ClTALE蛋白具有較大的氨基酸數(shù)目和相對(duì)分子質(zhì)量差異。此外，這些蛋白主要是酸性蛋白，并且具有親水性特點(diǎn)。

2.2 西瓜TALE基因的染色體定位

根據(jù)在葫蘆科數(shù)據(jù)庫中得到的ClTALEs基因組注釋文件，用TBtools軟件分析了19個(gè)西瓜TALE基因在染色體上的具體位置（圖1）。結(jié)果顯示，西瓜ClTALEs不均勻地分布在10條染色體上，其中第03、第04、第06、第09和第11號(hào)染色體上僅存在1個(gè)TALE基因，第01和第10號(hào)染色體上各有2個(gè)基因，第05和第08號(hào)染色體上各有3個(gè)基因，第02號(hào)染色體上分布了最多的TALE基因，共計(jì)4個(gè)（表2，圖1）。

2.3 西瓜和擬南芥TALE基因進(jìn)化關(guān)系分析

利用MEDGA7軟件分析了22個(gè)擬南芥TALE基因和19個(gè)西瓜TALE基因的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)19個(gè)西瓜TALE基因蛋白序列和22個(gè)擬南芥TALE基因蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。參考擬南芥TALE基因家族的研究結(jié)果，將西瓜TALE基因家族分為BEL1-like和KNOX 2個(gè)亞家族。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，將41個(gè)TALE基因分為3個(gè)組：第1組為BEL1-like亞家族，共包括23個(gè)基因，其中13個(gè)TALE基因來自擬南芥，而另外10個(gè)為西瓜TALE基因；第2、第3組為KNOX轉(zhuǎn)錄因子，又可進(jìn)一步劃分為2個(gè)分支Class I和Class II。第1個(gè)分支Class I共包括11個(gè)基因，其中4個(gè)TALE基因來自擬南芥，而另外7個(gè)為西瓜TALE基因；第2個(gè)分支Class II共包括6個(gè)基因，其中4個(gè)TALE基因來自擬南芥，而另外2個(gè)為西瓜TALE基因。

2.4 西瓜TALE基因家族的結(jié)構(gòu)特征分析

為了更好地理解西瓜TALE基因家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，首先通過構(gòu)建帶有ClBEL1-like和ClKNOX家族基因DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）來進(jìn)行分析。利用MEME在線網(wǎng)站獲得西瓜TALE基因的12個(gè)保守基序（motif 1～motif 12）類型（表3）及具體基序標(biāo)識(shí)（圖3）。同時(shí)，為了鑒定西瓜中TALE基因家族的結(jié)構(gòu)特征，將cDNA序列與其相應(yīng)的基因組DNA序列進(jìn)行比較，并利用基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（GSDS）對(duì)ClBEL1-like亞家族基因和ClKNOX亞家族基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析（圖4-a、圖4-c）。還利用Multiple Em for Motif Elicitation（MEME）程序，分別分析了ClBEL1-Like和ClKNOX成員的蛋白質(zhì)序列（圖4-b）。

從基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4-c）發(fā)現(xiàn)，所有的ClTALE成員的外顯子數(shù)量在4～10，平均數(shù)為5.37。其中，ClBEL1-like亞家族基因的外顯子數(shù)量主要集中在4～6，只有ClBLH06含有7個(gè)外顯子。ClKNOX亞家族基因的外顯子數(shù)量大多在4～6，但ClKN06含有8個(gè)外顯子，而ClKN01則含有10個(gè)外顯子。這些結(jié)果表明，在西瓜TALE基因家族中，基因結(jié)構(gòu)普遍展現(xiàn)出外顯子和內(nèi)含子的高度保守分布。

BEL1-Like蛋白和KNOX蛋白是兩種關(guān)鍵的植物發(fā)育相關(guān)蛋白。BEL1-like蛋白包含1個(gè)Homeodomain結(jié)構(gòu)域（也稱為Homeobox），這個(gè)結(jié)構(gòu)域與Homeobox_KN結(jié)構(gòu)域共享相似序列。此外，BEL1-like蛋白還包括1個(gè)POX結(jié)構(gòu)域（也稱為MID），其中包含SKY和BEL1區(qū)域。KNOX蛋白含有1個(gè)MEINOX結(jié)構(gòu)域，由KNOX1和KNOX2子域組成，它們之間被柔性連接子、ELK結(jié)構(gòu)域和TALE同源結(jié)構(gòu)域分隔。MEINOX結(jié)構(gòu)域能夠促進(jìn)KNOX和BELL蛋白之間的相互作用?；蚪Y(jié)構(gòu)分析證明，所有的ClBEL1-like成員都保守地包含TALE同源結(jié)構(gòu)域和POX結(jié)構(gòu)域（圖4-d），而所有的ClKNOX成員都保守地包含KNOX1和KNOX2（MEINOX）結(jié)構(gòu)域，但是ClKN03缺失了ELK結(jié)構(gòu)域（圖4-e）。

2.5 西瓜TALE基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

前人的研究表明，TALE基因家族參與調(diào)控花器官發(fā)育、花分生組織形成、器官形態(tài)發(fā)生、果實(shí)發(fā)育、植物非生物脅迫響應(yīng)及激素響應(yīng)。使用在線軟件PlantCARE對(duì)西瓜TALE基因家族上游2000 bp啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并選擇與植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)以及激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件進(jìn)行分析。這些元件主要包括光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、干旱響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)等（圖5）。筆者旨在探究西瓜TALE基因家族在生物學(xué)過程中以及對(duì)植物激素和非生物脅迫反應(yīng)中的重要作用。分析表明，分布最廣的是光響應(yīng)相關(guān)元件（Light responsiveness）（含元件基因數(shù)/總基因數(shù)為 19/19），其次是茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJA-responsiveness）（11/19）、赤霉素響應(yīng)元件（gibberellin responsiveness）（7/19）、脫落酸響應(yīng)元件（abscisic acid responsiveness）（6/19）、低溫響應(yīng)元件（low-temperature responsiveness））（4/19）、干旱響應(yīng)元件（drought-inducibility）（4/19）；分布最少的為生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（1/19）和調(diào)控植物細(xì)胞分化元件（1/19），前者僅在ClKN06中分布，后者在ClBLH01中分布。由此可以推斷，ClTALEs在應(yīng)對(duì)光照、激素信號(hào)以及逆境脅迫等方面可能扮演著重要的角色，并且對(duì)西瓜的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。

2.6 西瓜TALE基因的組織表達(dá)特性

在對(duì)19個(gè)西瓜TALE基因進(jìn)行的表達(dá)特點(diǎn)分析中（圖6）發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谖鞴系牟煌鞴僦斜磉_(dá)存在差異。具體結(jié)果顯示，大部分BEL1-like亞家族基因在根、卷須、雌花和雄花中表達(dá)，而大部分KNOX亞家族基因則在莖、葉、雌花和雄花中表達(dá)。其中，ClBLH09在根中高表達(dá)，ClBLH01在卷須、雌花和雄花中高表達(dá)，ClBLH03在葉中高表達(dá)，ClKN06在莖和葉中高表達(dá)，ClKN01和ClKN02在莖中高表達(dá)，由此推測(cè)西瓜TALE基因家族可能參與了西瓜的生長(zhǎng)發(fā)育過程。

2.7 西瓜TALE基因?qū)Φ蜏孛{迫、干旱脅迫的響應(yīng)表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)分析低溫脅迫和干旱脅迫下西瓜TALE家族基因的表達(dá)特性，結(jié)果（圖7-a）顯示，在低溫0 h時(shí)，除了ClBLH03、ClBLH07、ClBLH08、ClKN05和ClKN09這5個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在低溫3 h后，除了ClBLH02、ClBLH03、ClBLH07、ClBLH08、ClBLH10、ClKN02、ClKN04、ClKN08和ClKN09這9個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在低溫6 h后，除了ClBLH01、ClBLH02、ClBLH03、ClBLH06、ClBLH07、ClBLH08、ClBLH10、ClKN02、ClKN03、ClKN04、ClKN07和ClKN09這12個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在低溫12 h后，除了ClBLH05、ClBLH07、ClKN01、ClKN04、ClKN06和ClKN09這6個(gè)基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)外，其余基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)；在低溫24 h后，除了ClBLH01、ClBLH04、ClKN01和ClKN03這4個(gè)基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)外，其余基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)；在低溫36 h后，除了ClBLH01、ClBLH05、ClBLH09、ClKN01、ClKN03、ClKN06和ClKN08這7個(gè)基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)外，其余基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)；在低溫48 h后，除了ClBLH02、ClBLH03、ClBLH04、ClBLH07、ClKN01、ClKN04、ClKN06、ClKN08和ClKN09這9個(gè)基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。ClBLH08和ClKN02這2個(gè)基因在低溫脅迫下基本呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，ClKN01這個(gè)基因在低溫脅迫下基本呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，因此西瓜TALE基因家族可能在低溫脅迫中發(fā)揮作用。

結(jié)果（圖7-b）顯示，在干旱0 d時(shí)，除了ClBLH05、ClBLH08、ClBLH09、ClBLH10、ClKN03、ClKN04和 ClKN07這7個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱1 d后，除了ClBLH04、ClBLH05、ClBLH07、ClKN02、ClKN05和ClKN09這6個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱2 d后，除了ClBLH04、ClBLH05、ClBLH06、ClBLH09、ClKN01、ClKN03、ClKN05和ClKN09這8個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱3 d后，除了ClBLH04、ClBLH05、ClBLH06、ClBLH09、ClKN01、ClKN03、ClKN05、ClKN07和ClKN09這9個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱4 d后，除了ClBLH03、ClBLH04、ClBLH05、ClBLH08、ClBLH09、ClKN02、ClKN03和ClKN09這8個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱5 d后，除了ClBLH04、ClBLH05、ClBLH06、ClBLH08、ClKN02、ClKN05和ClKN09這7個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在干旱6 d、7 d和8 d后，除了ClBLH04、ClBLH05、ClBLH06、ClBLH09、ClKN01、ClKN03、ClKN05和ClKN09這8個(gè)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)外，其余基因呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。因此，西瓜TALE基因家族可能在干旱脅迫中發(fā)揮作用。

3 討論與結(jié)論

TALE基因家族在植物發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，在植物界分布廣泛，但在不同的植物物種中，這些基因的數(shù)量差異很大。TALE基因家族已經(jīng)在越來越多的植物中被詳細(xì)鑒定，其中包括擬南芥[26]、石榴[35]、番茄[36]、大豆[37]、蘿卜[38]、玉米[39]等，但在葫蘆科作物中尚未見到相關(guān)的研究報(bào)道。通過生物信息學(xué)方法，筆者對(duì)西瓜基因組中的TALE基因家族進(jìn)行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)西瓜TALE基因家族成員。這些基因在10條染色體上呈不均勻分布，與擬南芥中鑒定到的22個(gè)基因數(shù)量大致相符[23]。根據(jù)西瓜TALE基因家族結(jié)構(gòu)、保守基序分布及與擬南芥進(jìn)化關(guān)系分析，可將其分為BEL1-like和KNOX 兩個(gè)亞家族。其中BEL1-like蛋白包含1個(gè)Homeodomain結(jié)構(gòu)域（也稱為Homeobox），這個(gè)結(jié)構(gòu)域與Homeobox_KN結(jié)構(gòu)域共享相似序列。此外，BEL1-Like蛋白還包括1個(gè)POX結(jié)構(gòu)域（也稱為MID），其中包含SKY和BEL1區(qū)域。KNOX蛋白含有一個(gè)MEINOX結(jié)構(gòu)域，由KNOX1和KNOX2子域組成，它們之間被柔性連接子、ELK結(jié)構(gòu)域和TALE同源+REZAMndXzUdeA+IHEyZ80XiItVVXWQAer+IrNBQONw=結(jié)構(gòu)域分隔開來。MEINOX結(jié)構(gòu)域能夠促進(jìn)KNOX和BELL蛋白之間的相互作用。基因結(jié)構(gòu)分析證明，所有的ClBEL1-like成員都保守地包含TALE同源結(jié)構(gòu)域和POX結(jié)構(gòu)域，而所有的ClKNOX成員都保守地包含KNOX1和KNOX2（MEINOX）結(jié)構(gòu)域，但是ClKN03缺失了ELK結(jié)構(gòu)域。西瓜TALE基因家族中同一亞家族基因結(jié)構(gòu)相似，保守基序和內(nèi)含子外顯子的分布相似，這一結(jié)果與擬南芥TALE家族特征相似[23]，這一結(jié)果表明，同一亞家族的基因可能具有相似的功能。

順式作用元件通過參與基因表達(dá)的調(diào)控，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)產(chǎn)生影響。筆者使用在線軟件PlantCARE，針對(duì)西瓜TALE基因家族上游2000 bp啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)行了順式作用元件的預(yù)測(cè)。選擇了與植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)以及激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件進(jìn)行了分析。這些元件包括光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、干旱響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)等。分析結(jié)果顯示，光響應(yīng)相關(guān)元件的分布最為廣泛，其次為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件；而生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和調(diào)控植物細(xì)胞分化元件的分布則較為稀少。

通過綜合分析順式作用元件、組織表達(dá)和非生物脅迫表達(dá)等結(jié)果，推測(cè)西瓜TALE基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花器官發(fā)育以及抵抗非生物脅迫方面扮演著重要角色。在本研究中發(fā)現(xiàn)，西瓜TALE基因家族在光反應(yīng)、激素反應(yīng)和非生物脅迫中扮演著至關(guān)重要的角色，這與在番茄[36]和石榴[37]中的研究結(jié)論一致。筆者利用西瓜種質(zhì)M08的不同組織提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，通過qRT-PCR試驗(yàn)獲取西瓜TALE基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，大部分BEL1-like亞家族基因在根、卷須、雌花和雄花中表達(dá)，而大部分KNOX亞家族基因則在莖、葉、雌花和雄花中表達(dá)。其中，ClBLH09在根中高表達(dá)，ClBLH01在卷須、雌花和雄花中高表達(dá)，ClBLH03在葉中高表達(dá)，ClKN06在莖和葉中高表達(dá)，ClKN01在莖中高表達(dá)，由此推測(cè)西瓜TALE基因家族可能參與了西瓜的生長(zhǎng)發(fā)育過程。

TALE基因家族廣泛存在于植物中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。番茄SlBELL的啟動(dòng)子區(qū)域包含許多與植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的順式元件。SlBELL基因在組織中具有不同的特異性表達(dá)模式，并且對(duì)冷、熱和干旱脅迫有響應(yīng)，暗示它們?cè)谡{(diào)控植物生長(zhǎng)的多個(gè)方面以及響應(yīng)非生物脅迫方面具有潛在的功能[40]。研究表明CsKNOX在茶葉中的轉(zhuǎn)錄水平與黃烷-3-醇和原花青素的積累密切相關(guān)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CsKNOX基因?qū)Ω珊?、鹽、低溫脅迫以及外源MeJA和GA3均有響應(yīng)[41]。在棉花TALE基因家族中GhKNOX4-A和GhKNOX22-D都調(diào)節(jié)植物耐受性；沉默這2個(gè)基因會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為SOD活性降低和葉片細(xì)胞死亡，并增強(qiáng)氣孔開放和水分流失。因此，GhKNOX4-A和GhKNOX22-D可能通過調(diào)節(jié)氣孔開放和氧化應(yīng)激來參與干旱響應(yīng)[42]。在苜蓿TALE基因家族中，KNAT3/4/5-like轉(zhuǎn)錄因子可能通過抑制脯氨酸脫氫酶基因（MtPDH）表達(dá)來加速脯氨酸積累以應(yīng)對(duì)脅迫和保護(hù)細(xì)胞膜在免受干旱誘導(dǎo)的滲透脅迫中發(fā)揮作用[41]。在擬南芥中TaKNOX11-A增強(qiáng)了擬南芥的耐旱性和耐鹽性。TaKNOX11-A過表達(dá)的植物丙二醛含量降低，脯氨酸含量增加，使植物更有效地適應(yīng)不利環(huán)境[43]。通過對(duì)西瓜TALE基因家族在低溫脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因可能在這兩種脅迫情況下發(fā)揮作用。這一結(jié)論與之前的相關(guān)研究所得到的結(jié)果相一致[31-33]。

在本試驗(yàn)中共鑒定得到了19個(gè)西瓜TALE基因，可分為2個(gè)亞家族，根據(jù)各基因在染色體上的位置依次命名為ClBLH01～ClBLH10、ClKN01～ClKN09。通過綜合分析順式作用元件、組織表達(dá)和非生物脅迫表達(dá)等結(jié)果，推測(cè)西瓜TALE基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花器官發(fā)育以及抵抗非生物脅迫方面扮演著重要的角色。本研究結(jié)果可以為西瓜TALE基因家族的功能研究打下基礎(chǔ)，并促進(jìn)其在低溫和干旱脅迫下西瓜遺傳改良中的應(yīng)用。然而，對(duì)各個(gè)基因的具體功能仍需要進(jìn)一步研究。筆者對(duì)西瓜TALE基因家族成員進(jìn)行了全基因組的鑒定和分析，為將來對(duì)該基因家族功能的驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)。

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