一株高效溶磷細菌的篩選鑒定及溶磷效果的研究

李娜，洪堅平，謝英荷，喬志偉，李元，張平

(山西農業(yè)大學 資源環(huán)境學院，山西 太谷 030801)

一株高效溶磷細菌的篩選鑒定及溶磷效果的研究

李娜，洪堅平，謝英荷，喬志偉，李元，張平

(山西農業(yè)大學 資源環(huán)境學院，山西 太谷 030801)

從石灰性土壤中分離篩選出一株高效溶磷細菌W05，通過形態(tài)觀察和生理生化以及16sRNA對其進行了鑒定，確定此菌株屬于假單胞菌屬，將它培養(yǎng)7 d后，磷酸三鈣、磷礦粉、磷酸鐵和磷酸鋁培養(yǎng)液中的磷含量分別為563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1。將W05與雞糞混合制成溶磷菌肥，盆栽油菜試驗結果表明：溶磷菌肥顯著提高土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜產量與吸磷量；同時施用磷礦粉，各項指標均顯著提高，比起單施菌肥處理，磷礦粉施入量為1 g·盆-1時，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜鮮重、干重、吸磷量分別增加了46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1%；磷礦粉施入量為2 g·盆-1與1 g·盆-1處理相比，上述指標分別增加了14.8%、2.5%、1.4%、22.0%、5.9%；但是，磷礦粉施入量為3 g·盆-1與2 g·盆-1的各項指標差異不顯著?？梢姡瑢⒁欢舛攘椎V粉與溶磷菌混合使用，可以提高磷礦粉有效性，增加土壤有效磷含量。

溶磷細菌；溶磷菌肥；磷礦粉；溶磷作用

磷是植物生長所必需的礦質元素，在植物生長、發(fā)育等生命活動中起著積極的作用[1]。山西的土壤以石灰性土壤為主，全磷含量約在0.10%～0.15%之間[2]，但大部分磷素由于被固定而處于無效狀態(tài)[3]，土壤中可被植物吸收利用的磷僅占全磷量的1%[4]全省耕地土壤缺有效磷的現象十分嚴重，大量施用磷肥不僅增加了農業(yè)生產成本，而且造成了資源的浪費，同時也引起了環(huán)境污染。

土壤中含有大量的微生物，能夠將難溶性磷轉化為植物直接可吸收利用的可溶性磷[5]。

有關溶磷微生物研究和應用，我國已有60多年歷史[6，7]，有關溶磷菌對磷礦粉的溶解作用，大多是室內液體培養(yǎng)條件下的研究結果[8]，少量的實際應用研究也是將溶磷微生物作為肥料直接施入土壤，監(jiān)測其對土壤有效磷含量的影響和對作物的促生作用[9，10]，對施入土壤磷礦粉的溶磷作用研究較少。本試驗從山西農業(yè)大學農學院實驗站土壤中分離篩選出一株高效溶磷細菌W05，通過形態(tài)觀察和生理生化以及16sRNA對其進行了鑒定，并將其與有機肥混合制成菌肥，通過油菜盆栽試驗，研究了溶磷菌肥對不同磷礦粉用量土壤養(yǎng)分和油菜產量的影響，為溶磷菌生物有機肥合理施用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 分離篩選土樣

供試土壤取自山西農業(yè)大學農學院實驗站。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 初篩培養(yǎng)基(改良后的PVK培養(yǎng)基)

葡萄糖10 g，磷酸三鈣5 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸膏0.5 g，氯化鈉0.2 g，氯化鉀0.2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸亞鐵0.002 g，硫酸錳0.002 g，0.4%溴酚藍(pH 6.7)6 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

1.2.2 復篩培養(yǎng)基(NBRIP培養(yǎng)基)

葡萄糖10 g,磷酸三鈣5 g，氯化鎂5 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸銨0.1 g，氯化鉀0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

1.2.3 活化培養(yǎng)基(NA細菌培養(yǎng)基)

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL。

1.3 溶磷菌的分離篩選和溶磷能力的測定

1.3.1 分離篩選

稱取10 g新鮮土樣溶于90 mL無菌水中，用10倍稀釋法分別配制10-5、10-6、10-7的土壤懸液，分別涂布至分離培養(yǎng)基上, 30℃培養(yǎng)2～4 d，觀察出現溶磷圈的菌落, 根據是否產生溶磷圈來初步確定篩選的溶磷細菌，用平板劃線分離純化后保存于細菌培養(yǎng)基斜面上。

1.3.2 溶磷作用

將細菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的菌接入無菌水中，充分振蕩搖勻，制備成菌懸液，菌數大于108CFU·mL-1備用。在250 mL三角瓶中加入100 mL已滅菌的NBRIP液體培養(yǎng)基和難溶態(tài)磷酸鹽(磷酸三鈣，磷礦粉，磷酸鐵和磷酸鋁)，加入量為5 g·L-1，接種菌懸浮液1 mL，于30℃ 150 r·min-1下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后取發(fā)酵液在4℃ 6000 r·min-1離心10 min，取上清液測定發(fā)酵液中磷含量，并設置不接菌處理，每個處理重復3 次。

1.4 鑒定

1.4.1 形態(tài)和生理生化鑒定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)[11]進行形態(tài)觀察和生理生化試驗。

1.4.2 16SrDNA序列測定

采用引物7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)，1540r (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)建立擴增反應體系并測序，將獲得的DNA序列輸入GenBank，用Blast程序與數據庫中所有序列進行比對，根據親緣關系確定其種屬。

1.5 盆栽試驗

1.5.1 供試土壤

供試土壤取自山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院實驗站0～20 cm耕層土壤，屬于石灰性褐土，基礎土壤養(yǎng)分含量為：全氮1.31 g·kg-1、堿解氮36.34 mg·kg-1、全磷0.23 g·kg-1、有效磷15.56 mg·kg-1、全鉀1.26 g·kg-1、速效鉀97.41 mg·kg-1、有機質14.27 g·kg-1、pH 7.6。

1.5.2 供試作物

油菜，品種為四月蔓。

1.5.3 供試肥料

1)多酶金緩釋尿素：來自永濟中農化工有限公司，含氮量為46%；

2)磷礦粉：秦皇島市撫寧化學工業(yè)有限公司；含五氧化二磷磷量為19%；

3)硫酸鉀：晉中開發(fā)區(qū)中資化工技術有限公司，含氧化鉀54%；

4)磷細菌肥：將W05發(fā)酵培養(yǎng)后與風干雞糞按1∶4的比例混勻制成?；罹鷶荡笥?×107CFU·g-1。

1.5.4 試驗設計

盆栽試驗于2013年4-6月在山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院實驗站日光溫室內進行。試驗用盆缽為盆底直徑30 cm，高27 cm的聚乙烯塑料盆, 土壤過2 mm篩后，每盆裝風干土5 kg。試驗設計方案見表1，共15個處理，每個處理3次重復。

表1 試驗設計/g·盆-1

1.5.5 測定項目與方法

在油菜收獲后采集土壤樣品，土樣自然風干、研磨，過1 mm篩，測定其有效磷含量-NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；磷酸酶活性-磷酸苯二鈉比色法；植物吸磷量-釩鉬黃比色法。

1.6 統計分析

采用Excel、SAS軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌的分離、篩選

經過對采集的土樣進行溶磷菌的分離和初篩，初篩得到8 株溶磷細菌，經過篩選和活化，部分菌株降低或失去溶磷作用，不再生長，最終篩選出一株溶磷能力穩(wěn)定且長勢良好的溶磷細菌W05。該菌株短桿狀，無芽孢，直徑0.5～1.0 mm，在細菌培養(yǎng)基平板上為黃色，表面干燥，無凸起，革蘭氏陰性菌。經過鑒定，菌株W05的序列長度為1454 bp，通過BLAST軟件與Genbank中的序列比較，得到W05菌株與Pesudomonas sp (JF820 108.1)、Pesudomonas sp (AM934 699.1)及Pesudomonas sp(KC195 898.1)的序列同源性均大于99%，結合其形態(tài)和生理生化反應，鑒定其為Pesudomonas sp。

2.2 W05溶磷能力

W05對磷礦粉、磷酸鋁和磷酸鐵的溶磷能力如表2，W05對磷礦粉、磷酸鐵和磷酸鋁的溶磷量分別為21.27、149.54、88.06 mg·L-1，由表2可知，溶磷細菌W05對各種難溶態(tài)磷酸鹽都有一定的溶解能力。

表2 溶磷細菌W05對難溶態(tài)磷酸鹽的溶解能力

2.3 土壤有效磷、有機磷、磷酸酶及油菜產量

2.3.1 溶磷菌肥與不同濃度磷礦粉配施對油菜土壤有效磷、磷酸酶、有機磷的影響

由圖1左圖可以看出各處理油菜土壤有效磷含量顯著高于CK處理。單施菌肥的處理(處理1)比CK處理,有效磷含量增加了128.67%。土壤有效磷含量隨磷礦粉施入量的增加而增加，施入磷礦粉1 g·盆-1時土壤有效磷含量顯著高于單施菌肥的處理，增加了46.43%，隨著磷礦粉施入量增加，土壤有效磷含量依次增加了14.76%、0.60%，但處理1、2、3之間差異不顯著。

由圖1右圖可以看出各處理油菜土壤磷酸酶活性顯著高于CK處理。單施菌肥的處理(處理1)比CK處理磷酸酶活性增加了14.46%。土壤磷酸酶活性隨磷礦粉施入量的增加而增加，施入磷礦粉1 g·盆-1時土壤磷酸酶活性顯著高于單施菌肥的處理，增加了7.08%，隨著磷礦粉施入量增加，呈增速降低的趨勢，處理1、2、3之間差異不顯著，依次增加了2.48%、降低了0.77%，可見磷礦粉施入2 g·盆-1和3 g·盆-1時，土壤磷酸酶活性變化很小。

圖1 不同濃度磷礦粉處理對油菜土壤有效磷含量和磷酸酶活性的影響

2.3.2 溶磷細菌與不同濃度磷礦粉配施對油菜產量及吸磷量的影響

由表3可知，各處理油菜產量和吸磷量均比CK高，可見施入菌肥可提高植物產量，比較處理1、2可知，施加磷礦粉，油菜鮮重、油菜干重、吸磷量顯著增加，分別增加了9.6%、9.7%、3.1%。 隨磷礦粉施入量的增加，油菜產量和吸磷量增加，但增加幅度降低，施入量1 g·盆-1和2 g·盆-1兩個處理，油菜干重、吸磷量差異顯著，磷礦粉施入量3 g·盆-1的處理比2 g·盆-1的處理，油菜鮮重、吸磷量的增加不顯著，油菜干重略有降低，降低的也不顯著，即施入磷礦粉2 g·盆-1與3 g·盆-1的處理油菜生長差異不顯著，這表明，在每盆施入菌肥10 g后，施入磷礦粉2 g·盆-1和3 g·盆-1這兩個處理作用效果差不多，所以可以適量減少磷礦粉的施入量來節(jié)約成本。

表3 不同濃度磷礦粉處理的油菜產量及養(yǎng)分含量

3 討論與結論

本試驗從石灰性土壤中分離篩選出一株高效溶磷細菌W05，鑒定其為假單胞菌屬，培養(yǎng)7d后W05在磷酸三鈣、磷礦粉、磷酸鐵和磷酸鋁培養(yǎng)液中的有效磷含量分別為563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1，可見W05具有高效地溶解磷酸三鈣的能力，并且對磷礦粉、磷酸鋁、磷酸鐵都有一定的溶解能力，因此W05可以作為溶磷菌肥的優(yōu)質菌株。

本試驗表明加入溶磷菌生物有機肥，提高了土壤中有效磷，改善了植物生長情況，使其產量增加。即施入溶磷細菌生物有機肥，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜產量與吸磷量顯著高于CK，分別提高了128.67%，14.46%，17.11%(鮮重)，76.53%(干重)，19.74%。表明溶磷微生物把難溶性磷轉化為有效態(tài)磷，促進植物對磷素的吸收和生長發(fā)育。

本試驗施入磷礦粉時，土壤有效磷含量及油菜產量、吸磷量顯著高于單施菌肥，即加入一定量難溶性磷磷礦粉，促進了溶磷菌的產酸產酶能力，加速了溶磷菌對難溶性磷的溶解。施入磷礦粉比單施菌肥，各項指標均顯著增加，磷礦粉施入量為1 g·盆-1的處理比單施菌肥處理，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜鮮重、干重、吸磷量分別增加了46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1%。磷礦粉能為微生物提供養(yǎng)料, 同時微生物能將磷礦粉中的磷轉化為植物可以直接利用的磷素。溶磷微生物產生質子和有機酸，通過交換、水解、絡合、整合等作用，使磷礦粉分解，不僅釋放出磷酸鹽，而且也釋放出鈣、鎂、鈉等離子，這些離子的水解將使培養(yǎng)液的酸度降低[12]。

本試驗比較了磷礦粉施入量為2 g·盆-1以及3 g·盆-1兩個處理，土壤有效磷含量及油菜產量、吸磷量的變化均不顯著。磷礦粉施入量為3 g·盆-1的處理和2 g·盆-1的處理各項指標差異不顯著。加入磷礦粉在一定范圍內促進了溶磷菌的活性，但是施入量超過一定范圍時，由于溶磷細菌的活性有限，其溶磷活性不再隨磷礦粉施入量的增加而顯著增加。Narsianamp;Patel[13]發(fā)現Aspergillus aculeatus的溶磷量隨著磷礦粉加入量的增加而降低。

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TheIdentificationofaHighlyEfficientPhosphateSolubilizingBacteriumandItsImpactonOilrape

Li Na, Hong Jianping, Xie Yinghe, Qiao Zhiwei, Li Yuan, Zhang Ping

(CollegeofResourcesandEnvironment,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

We isolated a phosphorus dissolving bacteria strain names as W05 with strong phosphate-solubilizing activity from calcareous soil. It it belongs to the genus Pseudomonas based on its morphological, physiological and biochemical properties and the analysis of 16sRNA gene sequence. After cultivating 7 d, the phosphorus content in tricalcium phosphate, phosphate rock powder, ferric phosphate and aluminum phosphate liquid culture was 563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1, respectively. We made soluble phosphorus bacterial manure by mixing W05 with chicken manure, which was used for the following research. The results of potted rapeseed experiment show that: soluble phosphorus bacterial manure could increase soil available phosphorus content, phosphatase activity, rapeseed production and the uptake of phosphorus. Compared with single application of fertilizer, soil available phosphorus content, phosphatase activity, rapeseed fresh weight, dry weight and the uptake of phosphorus increased 46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1% with applied phosphate rock 1 g·pot-1, respectively. These indicators with the treatment of applied phosphate rock 2 g·pot-1were 14.8%、2.5%、1.4%、22.0%、5.9% higher than the treatment of applied phosphate rock 1 g·pot-1, respectively. However, the difference of each indicator was not significant between the treatment of applied phosphate rock 3 g·pot-1and 2 g·pot-1. Thus, application of a certain concentration of phosphate rock with phosphorus bacteria fertilizer into the soil could improve the phosphorus removal efficiency from phosphate rock and increase soil available phosphorus content.

Dissolved phosphorus bacteria; Soluble phosphorus bacterial manure; Phosphate rock powder; Dissolving effect

2014-07-03

2014-08-28

李娜(1989-)，女(漢)，山西太原人，在讀碩士研究生，研究方向：微生物肥料的研制與應用。

S154.3

A

1671-8151(2014)06-0526-05

(編輯：武英耀)