黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗感嘧霉胺菌株胞外酶活性比較研究

趙曉軍, 任璐,殷輝,周建波

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，山西 太原 030016；2.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗感嘧霉胺菌株胞外酶活性比較研究

趙曉軍1,2, 任璐2,3,殷輝1,2,周建波1,2

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，山西 太原 030016；2.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

比較了黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)抗感嘧霉胺菌株的胞外酶活性差異。以敏感菌株DT9、中抗菌株SZ5和高抗菌株SZ15為材料，在嘧霉胺藥劑處理下測(cè)定了胞外酶羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和果膠酶的活性。結(jié)果表明，藥劑處理后敏感菌株的胞外酶活性均升高，抗性菌株的胞外酶活性均降低。由此可見(jiàn)，黃瓜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗性后，抗性菌株胞外酶活性發(fā)生了變化。

灰霉病菌；嘧霉胺；抗藥性；羧甲基纖維素酶；β-葡萄糖苷酶；果膠酶

黃瓜是蔬菜產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，山西省黃瓜種植面積2012年達(dá)33 333公頃次。目前，黃瓜灰霉病在山西省黃瓜種植區(qū)普遍發(fā)生，并隨著保護(hù)地種植模式的推廣，近年來(lái)發(fā)生日趨嚴(yán)重[1,2]，直接影響著蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

灰霉病由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)侵染所致，該病菌具有寄主范圍廣、遺傳變異大、繁殖速度快和適合度高等特點(diǎn)，長(zhǎng)期使用單一藥劑易產(chǎn)生抗藥性[3,4]。然而，化學(xué)防治依然是生產(chǎn)上控制灰霉病的主要措施。目前，用于防治灰霉病的殺菌劑主要包括：苯并咪唑類(lèi)、氨基嘧啶類(lèi)、苯氟磺胺類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)、N-苯氨基甲酸酯類(lèi)等。據(jù)報(bào)道灰霉病菌已對(duì)多類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生了抗性，這是病原菌長(zhǎng)期在單一藥劑選擇作用下，通過(guò)遺傳、變異獲得的適應(yīng)性。特別是隨著高效、內(nèi)吸、選擇性強(qiáng)的殺菌劑被開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用，對(duì)殺菌劑的抗性越來(lái)越嚴(yán)重和普遍，成為制約化學(xué)防治措施發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[5]。

嘧霉胺是防治灰霉病的高效殺菌劑，已有多年用藥史。在我國(guó)遼寧和江蘇等地已經(jīng)報(bào)道了灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性菌株，在山西一些菜區(qū)也產(chǎn)生了抗藥性[6]。有研究表明，該藥劑能夠抑制病菌蛋氨酸的合成和胞壁水解酶的分泌[7]。為了進(jìn)一步探索灰霉病菌對(duì)嘧霉胺抗藥性的生化機(jī)理，了解抗感菌株的種群適合度，尋找新的、有效的抗藥性檢測(cè)方法與綜合治理措施，進(jìn)而指導(dǎo)殺菌劑的科學(xué)使用，本研究比較了黃瓜灰霉病菌抗感嘧霉胺菌株在藥劑處理下胞外酶的活性。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

所試病原菌均為采自山西省各地區(qū)的黃瓜灰霉病菌菌株，室內(nèi)已分離純化并檢測(cè)其對(duì)嘧霉胺的敏感性。選取敏感菌株DT9，中抗菌株SZ5及高抗菌株SZ15進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.2 酶液提取

收集不同含藥濃度下液體培養(yǎng)基的菌絲，用滅菌去離子水沖洗5次，真空抽濾后每份樣品取菌絲3 g。將菌絲置于預(yù)冷的研缽里，加入少量的液氮、石英砂及酶提取液。冰浴條件下磨成勻漿，勻漿后轉(zhuǎn)入10 mL離心管，最后在4 ℃條件下10 000 rpm離心15 min，取上清液做酶液，置冰浴中待用。

1.3 酶活力測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及胞外酶活性的測(cè)定采用袁勝東[8]等的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成，差異顯著性測(cè)驗(yàn)采用SPSS軟件完成。

2 結(jié)果與分析

胞外酶活性測(cè)定

嘧霉胺不處理?xiàng)l件下，如表1所示，敏感菌株DT9(CK)的羧甲基纖維素酶(CMC)、β-葡萄糖苷酶(BG)、果膠酶(PG)3種酶活性與高抗菌株SZ15相比相對(duì)較高，分別達(dá)到414.34 U·g-1、392.48 U·g-1、0.73 U·g-1。中抗菌株SZ5(CK)的羧甲基纖維素酶(CMC)、β-葡萄糖苷酶(BG)、果膠酶(PG)3種酶活性與高抗菌株SZ15相比相對(duì)較高，分別達(dá)到424.45 U·g-1、400.47 U·g-1、0.73 U·g-1。

表1 嘧霉胺對(duì)其抗感菌株胞外酶活性的影響/U·g-1

注：同一行數(shù)據(jù)后標(biāo)明不同小寫(xiě)字母表示0.05水平差異顯著，SPSS12.0鄧肯氏新復(fù)級(jí)差法。

Note：The same line followed by the different small letters show the significant difference at 5% level, SPSS12.0 Duncan,s new multiple range test.

嘧霉胺處理后，如表1所示，敏感菌株DT9的羧甲基纖維素酶(CMC)和β-葡萄糖苷酶(BG)活性較對(duì)照增大，分別達(dá)到531.45 U·g-1和461.80 U·g-1。中抗菌株SZ5的CMC活性與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異，高抗菌株SZ15的CMC活性較對(duì)照有所降低，僅為59.53 U·g-1。藥劑處理后，SZ5和SZ15的BG活性均較對(duì)照有所降低，SZ15的BG活性?xún)H為59.53 U·g-1。DT9與SZ15的CMC和BG活性在5%水平均存在顯著差異。

DT9和SZ5的果膠酶(PG)活性較對(duì)照沒(méi)有顯著差異， SZ15的PG活性較對(duì)照顯著降低，藥劑處理后SZ15的PG活力僅為0.08 U·g-1。

3 討論

植物細(xì)胞壁對(duì)保持細(xì)胞的形態(tài)和保護(hù)細(xì)胞的完整性有著重要的作用，而植物病原菌在侵入和定殖的過(guò)程中可以分泌多種胞外細(xì)胞壁降解酶，使得病原菌反復(fù)接觸并穿透寄主細(xì)胞壁。病原菌細(xì)胞壁降解酶與寄主細(xì)胞壁的相互作用直接影響到寄主和病原菌關(guān)系的平衡[9]。這種相互作用直接影響病原菌的致病過(guò)程。

本研究測(cè)定了嘧霉胺抗感菌株羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶3種細(xì)胞壁相關(guān)酶的活性，研究結(jié)果顯示，嘧霉胺處理后，敏感菌株羧甲基纖維素酶和β-葡萄糖苷酶酶活性均升高，果膠酶沒(méi)有明顯變化，中抗菌株的β-葡萄糖苷酶活性降低，其余兩種酶沒(méi)有顯著變化，而高抗菌株3種酶的活性均降低。由此可見(jiàn)，與敏感菌株相比，灰霉病菌抗性菌株雖然在藥劑存在下可以存活，但菌株的致病力顯著降低。有研究表明，不同抗感菌株產(chǎn)生的纖維素活力有明顯不同，強(qiáng)致病力的菌株產(chǎn)生的酶活性較高，而侵染速率慢的菌株產(chǎn)生的纖維素酶活力低[10]，這反應(yīng)了菌株致病力強(qiáng)弱與酶活性呈正相關(guān)，對(duì)抗感菌株致病力強(qiáng)弱的鑒定有重要意義。

結(jié)合抗感菌株胞外酶活性和其接種后的病斑面積(數(shù)據(jù)另文待發(fā))進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌株羧甲基纖維素酶活性和β-葡萄糖苷酶與病斑面積相關(guān)性不明顯，而果膠酶與病斑面積緊密相關(guān)，推測(cè)果膠酶在病原菌的致病過(guò)程中起著較為重要的作用。這一結(jié)果與周葉方等[11]報(bào)道的一些植物病原細(xì)菌的致病關(guān)鍵酶是果膠酶的結(jié)果相一致。這一結(jié)果也在一定程度上反映了灰霉病菌的致病機(jī)制。

另外，近年來(lái)相關(guān)報(bào)道顯示，灰霉病菌在菌絲生長(zhǎng)速率、病原菌致病性及抗藥性的表現(xiàn)型等方面具有極其豐富的多樣性[12～14]。結(jié)合上述研究結(jié)果，推測(cè)灰霉病菌的三種酶活性變化規(guī)律可能是灰霉病菌在酶表現(xiàn)型的多樣性體現(xiàn)。

黃瓜灰霉病菌(B.cinerea)對(duì)嘧霉胺敏感性菌株3種胞外酶(羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶)的活性相對(duì)較高，表明黃瓜灰霉病菌(B.cinerea)對(duì)嘧霉胺敏感性菌株種群適合度較高。綜上所述，無(wú)藥劑選擇壓時(shí)，嘧霉胺抗性菌株的致病力弱于敏感菌株，敏感菌株相對(duì)容易侵染寄。這一研究結(jié)果需今后進(jìn)一步探索相關(guān)證據(jù)加以證明。且本研究?jī)H探討了3株抗感菌株，今后還需大量菌株進(jìn)行測(cè)定，為嘧霉胺抗藥性機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

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ComparisonofEctoenzymeActivitiesBetweenSensitiveandResistantIsolatesofBotrytiscinereatoPyrimethanil

Zhao Xiaojun1,2,Ren Lu2,3,Yin Hui1,2,Zhou Jianbo1,2

(1.InstituteofPlantProtection,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,TaiyuanShanxi030016,China; 2.ShanxiKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,TaiyuanShanxi030006,China; 3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

To explore the resistance mechanism ofBotrytiscinereato pyrimethanil, this study compared ectoenzyme activities between sensitive and resistant isolates.The activities of CMC, BG and pectinase of sensitive strain DT9, resistant strains SZ5 and SZ15 were tested with or without the treatment of the fungicide. The results showed that activity of CMC, BG and pectinase of sensitive strain were increased, but resistant strains were reduced when treated with the fungicide. Thus ectoenzyme activities of the resistant isolates were significantly different from the sensitive strain.

Botrytiscinerea; Pyrimethanil；Resistance; Carboxymethyl cellulase；β-glucosidase; Pectinase

2014-09-11

2014-10-14

趙曉軍(1974-)，男(漢)，山西臨汾人，副研究員，博士，研究方向：殺菌劑生測(cè)及抗藥性研究。

山西省基金項(xiàng)目(2010021033)；山西省農(nóng)科院育種工程項(xiàng)目(11yzgc144；YZJC1309)

S481+.4

A

1671-8151(2014)06-0508-03

(編輯：武英耀)