洱海沉積物中反硝化細(xì)菌的分離與反硝化作用研究

奎一平, 張 文, 林麗佳, 倪兆林, 申元英*

1.大理市環(huán)境保護(hù)局, 云南 大理 671000;

2.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院, 云南 大理 671000

硝化和反硝化過(guò)程是無(wú)機(jī)氮生物化學(xué)循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)，它們通過(guò)微生物的生化過(guò)程將銨鹽轉(zhuǎn)化為可溶性的硝酸鹽、亞硝酸鹽，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氮?dú)夂脱趸瘉喌猍1]，其反應(yīng)物銨鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽是引起海水富營(yíng)養(yǎng)化的主要化學(xué)物質(zhì)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多研究已經(jīng)證明，細(xì)菌的反硝化作用不僅可在厭氧條件下進(jìn)行，同時(shí)也可在好氧條件下進(jìn)行[2，3]。

洱海位于云貴高原，大理白族自治州境內(nèi)，為云南省第二大淡水湖泊，洱海全湖面積256 km2，平均水深10.5 m，容積27.7億m3，是大理州生態(tài)、經(jīng)濟(jì)及社會(huì)發(fā)展的基礎(chǔ)條件。近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)洱海開發(fā)活動(dòng)的不斷加劇，洱?，F(xiàn)正處于中營(yíng)養(yǎng)水平向富營(yíng)養(yǎng)湖泊的過(guò)渡階段[4]，洱海沉積物中氮磷含量較高而且藍(lán)藻水華每年夏秋季都會(huì)頻繁地在大部分湖灣發(fā)生，為應(yīng)對(duì)環(huán)境問(wèn)題，針對(duì)洱海水質(zhì)、水生動(dòng)植物及沉積物等都進(jìn)行了廣泛的研究[5～8]。盡管近年來(lái)加大了對(duì)洱海的治理，但湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的進(jìn)程依然是困擾洱?？沙掷m(xù)發(fā)展的重要問(wèn)題。因此，本文擬從洱海沉積物中分離篩選出具有較強(qiáng)反硝化能力的細(xì)菌，并進(jìn)行反硝化作用分析，以為后續(xù)反硝化細(xì)菌的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品來(lái)源

根據(jù)2009年對(duì)洱海水質(zhì)和沉積物各指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)，從洱海18個(gè)常規(guī)采樣點(diǎn)中設(shè)10個(gè)點(diǎn)位(21#、68#、73#、100#、105#、121#、132#、142#、177#和209#)，湖泊采樣時(shí)采用GPS定位技術(shù)準(zhǔn)確定位，確定采樣點(diǎn)。用GPS儀記錄下位點(diǎn)經(jīng)緯度坐標(biāo)，使用Google earth軟件做出采樣位點(diǎn)實(shí)際分布圖，再根據(jù)實(shí)際分布圖使用Photoshop CS2軟件做出采樣位點(diǎn)示意圖(見圖1)。采樣船只為中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院洱?；卣{(diào)查船，用自制表層采樣器采集表層沉積物，裝入無(wú)菌離心管中，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖1 洱海采樣點(diǎn)位分布圖

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；JA1203N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸氣滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3主要培養(yǎng)基

反硝化液體培養(yǎng)基：KNO32 g/L、MgSO40.2 g/L、KH2PO40.5 g/L、酒石酸鉀鈉20 g/L，pH 7.2。

檸檬酸鹽培養(yǎng)基：檸檬酸鈉2 g/L、K2HPO41 g/L、NH4H2PO41 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO40.2 g/L、1％(V/V)溴麝香草酚藍(lán)(酒精溶液)；pH 6.8。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.2。

1.4反硝化細(xì)菌的分離純化

將采集的沉積物樣品稱取1g加入到裝有100 mL反硝化液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，混勻后，加棉塞塞口，30℃恒溫靜置培養(yǎng)3～4 d，至培養(yǎng)液變渾濁。取5 mL菌液接入裝有100 mL新鮮反硝化液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)，重復(fù)此操作2～3次；將富集培養(yǎng)后的菌液反復(fù)劃線培養(yǎng)直至出現(xiàn)單個(gè)菌落，即得到純化后的菌株。將純培養(yǎng)平板置于4℃冰箱備用。培養(yǎng)過(guò)程中用磺基苯磺酸和a-萘胺的混合溶液定性檢測(cè)菌株的反硝化能力，篩選出反硝化能力最強(qiáng)的菌株。

1.5反硝化細(xì)菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

分別挑起單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、干燥、革蘭氏染色和顯微鏡下觀察，并參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9，10]、《環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[11]進(jìn)行接觸酶(過(guò)氧化氫酶)試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和產(chǎn)脂酶(Tween 80)試驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.6菌株對(duì)硝酸鹽降解能力測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)洱海沉積物細(xì)菌培養(yǎng)純化，分離得到101株反硝化細(xì)菌。這些細(xì)菌均可在以硝酸鹽為唯一氮源的條件下生長(zhǎng)，為以后氮測(cè)試試驗(yàn)排除干擾。

2.2反硝化能力測(cè)定

將101株細(xì)菌分別接種于反硝化液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后向培養(yǎng)液中滴入1滴對(duì)磺基苯磺酸和a-萘胺的混合溶液。101株細(xì)菌的培養(yǎng)基顏色均變紅，證明有亞硝酸鹽產(chǎn)生。該101株細(xì)菌在液體培養(yǎng)過(guò)程中將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)變成亞硝酸鹽氮，實(shí)現(xiàn)了反硝化過(guò)程的第一步，具有反硝化能力。其中編號(hào)為EH314的菌株培養(yǎng)液顏色最深，說(shuō)明其反硝化能力最強(qiáng)，將該細(xì)菌作為研究對(duì)象。

2.3細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢后得到EH314為G-桿菌，排列不規(guī)則。

2.4生理生化特性

對(duì)EH314菌株生理生化特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該菌株能在30℃恒溫生長(zhǎng)，在有氧條件下能以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基中接觸酶(過(guò)氧化氫酶)產(chǎn)氣,能水解淀粉,硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性,葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果為氧化菌,產(chǎn)脂酶(Tween 80)試驗(yàn)結(jié)果為陰性，見表1。

表1 EH314菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.5菌株EH314對(duì)硝酸鹽降解能力測(cè)定

圖2 菌株EH314對(duì)硝酸鹽的降解

3 討論

洱海沉積物氮磷含量高于長(zhǎng)江中下游湖泊，文獻(xiàn)表明：洱海沉積物總氮平均為2 204.54 mg/kg[16]，總磷含量為307.43～1 454.39 mg/kg[17]，但低于處于劣Ⅴ類的滇池，總氮為8 670 mg/kg，總磷為3 460 mg/kg[18]。較高的氮磷含量，使洱海沉積物具有較大的釋放風(fēng)險(xiǎn)，而洱海水體卻保持較好。由于沉積物中存在大量反硝化細(xì)菌，并且這些細(xì)菌具有較強(qiáng)的反硝化能力。細(xì)菌通過(guò)反硝化作用，將沉積物中大量氮元素轉(zhuǎn)化為氣體(N2、N2O)逸散出水體，降低了沉積物對(duì)洱海上覆水中氮含量的貢獻(xiàn)，從而使洱海上覆水保持較好。作為反硝化作用的主體，研究洱海沉積物中反硝化細(xì)菌能夠?yàn)榻窈笾卫矶＜邦A(yù)測(cè)洱海水體變化提供重要信息。

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