浙貝乙素與浙貝乙素膽酸酯對(duì)人細(xì)胞色素P450酶活性的影響

吳瀟，彭瑛，張鵬，吳繼洲

[1.天津市中藥質(zhì)量控制(企業(yè))重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009;3.湖北省天然藥物與資源評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030]

湖北貝母為百合科貝母屬植物湖北貝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)的干燥鱗莖，被《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版收載，具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的功效[1]。系統(tǒng)研究表明，總生物堿為其活性部位[2-3]。其中主要單體成分浙貝乙素具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰活性[4-5]，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛能。蛇膽川貝散為一經(jīng)典中藥復(fù)方，臨床療效顯著，毒副作用小?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，生物堿和膽汁酸為其主要有效成分。本課題組借助結(jié)構(gòu)拼合的思路，合成了浙貝乙素與膽汁酸的系列酯化合物，經(jīng)藥效學(xué)篩選，浙貝乙素膽酸酯的鎮(zhèn)咳、祛痰活性最強(qiáng)，且毒性遠(yuǎn)低于浙貝乙素[5-6]。

代謝性藥物相互作用占藥動(dòng)學(xué)相互作用的40%，從1995年到現(xiàn)在，由代謝性藥物相互作用引起藥理或毒理效應(yīng)變化的臨床案例報(bào)道增加了10倍以上[7]。因此，在活性化合物開發(fā)的早期進(jìn)行代謝性相互作用的研究具有重要意義。筆者在本研究中采用體外混合探針底物法，對(duì)浙貝乙素和浙貝乙素膽酸酯對(duì)5種主要的人細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶亞型的抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為浙貝乙素及其衍生物的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥 浙貝乙素(純度＞98%)、浙貝乙素膽酸酯(純度＞98%)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院吳繼洲教授提供;奧美拉唑鈉鹽(批號(hào):100367-201104)、氫溴酸右美沙芬(批號(hào):100201-199901)、馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖(批號(hào):171250-200401)、左氧氟沙星(批號(hào):130455-201117，純度:98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲苯磺丁脲(批號(hào):017K1025)、睪酮(批號(hào):564026)購(gòu)自Fluka公司;非那西丁(批號(hào):016K1602)、對(duì)乙酰氨基酚(批 號(hào):099K0126V)、4-羥 基 甲 苯 磺 丁 脲 (批 號(hào):0001407794)、5-羥基奧美拉唑(批號(hào):1194-013A3)、右啡烷(批號(hào):BCBF7621V)、1-羥基咪達(dá)唑侖(批號(hào):065K3262)、6β-羥基睪酮(批號(hào):306461)購(gòu)自 Sigma 公司;十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4· 2H2O)、氯化鉀(KCl)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)購(gòu)自Sigma公司;其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 美國(guó)熱電公司Finnigan高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(含F(xiàn)innigan Surveyor高效液相色譜系統(tǒng)、Finnigan TSQ Quantum Discovery max質(zhì)譜系統(tǒng)、電噴霧離子源、Xcalibur1.2工作站及LCQuan數(shù)據(jù)處理軟件);色譜柱 Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm);Vortex-Genie 2 渦旋混合器;Eppendorf高速冷凍離心機(jī);Milli-Q Gradient A1超純水機(jī)。

1.3 人肝微粒體 混合人肝微粒體(human liver microsomes，HLMS)購(gòu)自瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司，由 10名捐獻(xiàn)者的肝臟制得，其 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 活性由瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司鑒定，微粒體蛋白濃度為10 mg ·(500 μL)－1。

1.4 肝微粒體體外孵育 溫孵反應(yīng)體系包括人肝微粒體(0.2 mg·mL－1)，氯化鎂(MgCl2，10 mmol·L－1)，磷酸鹽 緩 沖 液 (Na2HPO40.1mol· L－1，NaH2PO40.1 mol·L－1，KCl 0.1 mol·L－1，pH=7.4)，混合探針底物(CYP1A2/非那西丁/70 μmol·L－1，CYP2C9/甲苯磺丁脲/4 2.7 μmol·L－1，CYP2C19/奧美拉唑/22.6 μmol·L－1，CYP2D6/右美沙芬/4.05 μmol·L－1，CYP3A4/咪達(dá)唑侖/3.53 μmol·L－1，CYP3A4/睪酮/53.3 μmol·L－1)，以及受試化合物，反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑的含量≤1%。將反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min后，加入NADPH能量系統(tǒng)(其組成為:NADP/0.5 mmol·L－1，G-6-P/10 mmol·L－1，G-6-P-DH/1 U·mL－1)啟動(dòng)反應(yīng)，溫孵20 min后，0℃冰浴快速終止反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、浙貝乙素組和浙貝乙素膽酸酯組，空白對(duì)照組以溶劑甲醇代替試藥，浙貝乙素和浙貝乙素膽酸酯在溫孵反應(yīng)體系中的系列終濃度均為0.4，2，8，40，200 μmol·L－1。各溫孵反應(yīng)平行做3 份。

1.5 樣品處理與色譜分析 在溫孵體系中加入含內(nèi)標(biāo)(左氧氟沙星，200 ng·mL－1)的甲醇溶液(1∶1)沉淀蛋白，振蕩3 min，20 000 r·min－1離心10 min 后，取上清液進(jìn)樣，分析其中6種探針底物特征代謝物的濃度。色譜條件:Phenomenox Luna C18柱(2.0 mm ×150 mm，5 μm)，流 動(dòng) 相 為:(A)含 1‰ 甲 酸 的0.5 mmol·L－1醋酸銨緩沖液，(B)甲醇，梯度洗脫，0 ～2.0 min，5% ～50%B;2.0 ～6.0 min，50% ～60%B;6.0 ～7.0 min，60%B;7.0 ～7.5 min，60% ～5%B;7.5 ～ 12.0 min，5%B，流速為 200 μL·min－1，柱溫40℃。質(zhì)譜條件:ESI離子源:電噴霧電壓 4 400 V(+)，加熱毛細(xì)管溫度 350℃，鞘氣(N2)流速7.5 L·min－1(30 Arb)，輔助氣(N2)流速10 L·min－1(10 Arb)，碰撞氣(Ar)壓力0.2 Pa(1.5 mTorr)。正離子模式下同時(shí)掃描各代謝產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的母離子及產(chǎn)物離子，選擇豐度最大的碎片離子進(jìn)行多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，各化合物的 MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

1.6 IC50值的計(jì)算 受試化合物任一濃度水平下所測(cè)任一亞型代謝產(chǎn)物的生成量與相應(yīng)溶劑空白對(duì)照組中該代謝產(chǎn)物的生成量之比即為該化合物水平下所測(cè)亞酶活性的相對(duì)剩余活力百分?jǐn)?shù)，以其為縱坐標(biāo)(Y)，受試化合物的對(duì)數(shù)(Log10)摩爾濃度為橫坐標(biāo)(X)，借助軟件GraphPad Prism 4.0 demo擬合即可得到受試化合物對(duì)任一CYP亞型的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)抑制效應(yīng)圖。

表1 各化合物母離子和碎片離子MRM參數(shù)Tab.1 MRM parameter of parent ion and fragment ion of each compound

2 結(jié)果

2.1 各代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 在滅活的人肝微粒體溫孵體系中，加入系列濃度的混合探針代謝產(chǎn)物(0.066/0.014/0.0055/0.0058/0.0058/0.049，0.013/0.035/0.014/0.012/0.015/0.098，0.33/0.070/0.028/0.023/0.029/0.16，0.66/0.17/0.055/0.039/0.058/0.33，1.32/0.35/0.14/0.078/0.15/0.82，3.29/0.7/0.28/0.19/0.29/1.64，6.58/1.74/0.55/0.39/0.73/3.28，13.16/3.48/1.38/0.78/1.46/8.20，25.00/6.97/2.76/1.94/2.63/16.39 μmol·L－1，對(duì)乙酰氨基酚/4-羥基甲苯磺丁脲/5-羥基奧美拉唑/右啡烷/1-羥基咪達(dá)唑侖/6β-羥基睪酮)，按照“樣品處理與色譜分析”項(xiàng)處理分析。各特異性探針底物的線性回歸方程和線性范圍分別為:對(duì)乙酰氨基酚/CYP1A2:Y=0.136 1X － 0.003(R2=0.995 7，0.066 ～25.00 μmol·L－1);4-羥基甲苯磺丁脲/CYP2C9:Y=0.248 6X+0.001 5(R2=1.000 0，0.014 ～6.97 μmol·L－1);5-羥 基 奧 美 拉 唑/CYP2C19:Y=0.639 3X+0.002 3(R2=0.999 8，0.005 5 ～2.76 μmol·L－1);右啡烷/CYP2D6:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.066 ～ 16.39 μmol·L－1);1-羥基咪達(dá)唑侖/CYP3A4:Y=2.466 3X －0.007 9(R2=0.999 0，0.005 8 ～ 2.63 μmol·L－1);6β-羥基睪酮/CYP3A4:Y=0.121 9X －0.004 7(R2=0.991 0，0.049～16.39 μmol·L－1)。

2.2 浙貝乙素、浙貝乙素膽酸酯對(duì)人肝微粒體CYP酶活性的影響 浙貝乙素、浙貝乙素膽酸酯對(duì)人肝微粒體5種主要CYP酶亞型活性的影響分別見(jiàn)圖1，圖2。結(jié)果表明，浙貝乙素在 0 ～200 μmol·L－1范圍內(nèi)對(duì)CYP2C9亞型基本沒(méi)有抑制效應(yīng)，對(duì) CYP1A2，CYP2D6，CYP2C19，CYP3A4四種亞型有很弱的抑制效應(yīng)，抑制率≤50%。浙貝乙素膽酸酯在0～200 μmol·L－1范圍內(nèi)對(duì) CYP1A2 亞型有較強(qiáng)的抑制作用，IC50約為 128 μmol·L－1;對(duì) CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP3A4四種亞型有很強(qiáng)的抑制作用，IC50分別約為 4(CYP2C9)，8(CYP2C19)，5(CYP2D6)，3(CYP3A4，睪酮為底物)，11 μmol·L－1(CYP3A4，咪達(dá)唑侖為底物)。

圖1 浙貝乙素對(duì)5種人肝微粒體CYP酶亞型的抑制曲線Fig.1 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

3 討論

在藥物開發(fā)的早期階段，使用體外混合探針底物法進(jìn)行人肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)，可以經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、高通量地獲得候選化合物對(duì)體外肝微粒體CYP酶活性的影響，以期在綜合考慮藥理活性和對(duì)代謝酶影響等基礎(chǔ)上篩選出藥理活性高而又不易引起代謝性相互作用的候選藥物。理想的用于檢測(cè)CYP同工酶的探針底物應(yīng)該對(duì)特定的CYP酶亞型具有優(yōu)良的選擇性、敏感性以及可獲得性，本實(shí)驗(yàn)選擇的探針底物均為美國(guó)藥品研究和制造商協(xié)會(huì)(PhRMA)推薦使用的體外探針底物[8]。CYP3A4的配體結(jié)合位點(diǎn)具有顯著的催化區(qū)域?qū)Ｒ恍?，并?duì)改變底物特異性、蛋白結(jié)構(gòu)及協(xié)同性具有不同的作用[9]，因此在進(jìn)行體外考察藥物對(duì)CYP3A4活性的影響時(shí)，建議至少選擇兩種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的探針底物，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇睪酮和咪達(dá)唑侖兩種底物來(lái)考察浙貝乙素及其膽酸酯對(duì)CYP3A4的抑制作用。

圖2 浙貝乙素膽酸酯對(duì)5種人肝微粒體CYP酶亞型的抑制曲線Fig.2 Inhibition curves of five CYP isoforms in HLMS by verticinone

筆者采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的成熟的體外混合探針底物法，對(duì)具有良好鎮(zhèn)咳、祛痰活性的浙貝乙素及其衍生物浙貝乙素膽酸酯進(jìn)行了對(duì)人肝微粒體CYP酶活性影響的考察，結(jié)果表明浙貝乙素對(duì)考察的5種CYP酶亞型基本沒(méi)有或僅有很弱的抑制作用，而其衍生物浙貝乙素膽酸酯對(duì)考察的5種CYP酶亞型具有較強(qiáng)的抑制作用，表明浙貝乙素膽酸酯在藥物代謝性相互作用方面的安全性不如其母體(浙貝乙素)。浙貝乙素膽酸酯對(duì) CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制作用類型，尚需進(jìn)一步的酶促動(dòng)力學(xué)研究才能說(shuō)明。

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