改良構(gòu)建兔心肌缺血再灌注模型的體會

于宗良 陳樂 許浩軍 周偉偉 何敖林 鄧志勇 谷惠敏 楊向軍

基礎(chǔ)研究

改良構(gòu)建兔心肌缺血再灌注模型的體會

于宗良 陳樂 許浩軍 周偉偉 何敖林 鄧志勇 谷惠敏 楊向軍

作者單位：215300 江蘇省，昆山市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科（于宗良、許浩軍、周偉偉、何敖林、鄧志勇、谷惠敏）；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（陳樂、楊向軍）

目的 探討制作兔心肌缺血再灌注模型的改進(jìn)方法。方法 20只新西蘭大白兔，“六線六結(jié)”改良法開胸后，隨機以“雙線雙結(jié)”法結(jié)扎兔冠狀動脈左前降支（常規(guī)組，10只）和左室支（觀察組，10只）30 min，松結(jié)實施再灌注2 h后，取心測梗死面積。術(shù)前及再灌注2 h后，檢測血肌鈣蛋白I。結(jié)果 兩組制模成功率均為70%；兩組手術(shù)后肌鈣蛋白I較術(shù)前均明顯升高，左室支結(jié)扎組升高更明顯；觀察組造成的心肌梗死面積明顯大于常規(guī)組（P＜0.05），且變異小。結(jié)論 改良法可有效地提高兔心肌缺血再灌注模型構(gòu)建的成功率。

兔；模型； 缺血再灌注； 左室支

建立穩(wěn)定可靠的急性心肌缺血再灌注的動物模型，對研究急性心肌梗死的救治有重要意義。兔的心臟特性與人類相近，故常被選為模型動物。目前多采用開胸套扎冠狀動脈前降支（left anterior descending artery，LAD）的方法制模，但由于術(shù)中出血、氣胸、冠脈阻斷不徹底等發(fā)生率較高，制模成功率偏低[1-8]。我們在實驗中探索使用“六線六結(jié)”改良開胸、以“雙線雙結(jié)”結(jié)扎冠狀動脈左室支（left ventricular artery，LVA）等方法，提高了模型構(gòu)建的成功率，并簡化了操作，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔20只［合格證號：SYXK（蘇）2007-0035］，均為雄性，體重2.5 kg左右，兔齡6～8個月，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供。將新西蘭大白兔隨機分為2組。常規(guī)組（A組）10只，采用結(jié)扎LAD近端制作缺血再灌注模型，體重（2.45±0.70）kg；觀察組（B 組）10只，采用結(jié)扎 LVA 中段制備缺血再灌注模型，體重（2.47±0.60）kg。

1.2 實驗方法

1.2.1 “六線六結(jié)”開胸法 經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉溶液（約1 ml/kg）麻醉動物，術(shù)中給予心電監(jiān)護(hù)。胸部備皮、消毒后，沿胸骨與左肋骨連接處上方切開皮膚，鈍性分離肌肉，上下緣游離出2.5 cm左右的縱行切口，當(dāng)暴露胸骨及左側(cè)肋骨時，用3根長約15 cm的2-0縫線分別在貼近胸骨側(cè)，將第2～4肋骨連同周圍的肌肉及肋間血管一起結(jié)扎，再用3根同樣的線在原結(jié)扎處稍偏左2 mm處將第2～4肋骨及其周圍的肌肉血管一起結(jié)扎，用刀片從2～4肋骨結(jié)扎處中間將3根肋骨離斷，并鈍性分離肋間肌肉，通過牽拉左右兩側(cè)各3根縫線，將胸廓拉開擴大手術(shù)視野。此法即為我們研究使用的“六線六結(jié)”開胸法（見圖1）。隨后用小剪刀剪開胸膜、心包膜而暴露心臟。

1.2.2 “雙線雙結(jié)”結(jié)扎冠狀動脈 常規(guī)組（A組）結(jié)扎LAD。以肺動脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳下方3 mm處進(jìn)針將6-0帶線縫針穿過心肌，深度為2 mm，寬度為4 mm，與左冠狀靜脈平行放置一根2-0縫線于心臟表面。觀察20 min后，將穿過心肌的縫線交叉打一單結(jié)并拉緊兩端，同時將結(jié)下放置的與左冠狀靜脈平行的另一根縫線交叉打一活結(jié)，通過兩個結(jié)成功結(jié)扎LAD，即“雙線雙結(jié)”法[9]。觀察組（B組）選擇LVA結(jié)扎。在左心室中部無血管處用6-0帶線縫和針（提拉翻轉(zhuǎn)心臟用）穿過心肌，深度2 mm，寬度4 mm左右，提拉縫線，同時輔以濕棉簽外撬等，將心臟向右側(cè)翻轉(zhuǎn)，充分暴露LVA（見圖2）。取左心耳下緣與心尖連線中點（左緣靜脈分叉處）為LVA結(jié)扎平面，避開靜脈，同樣采用“雙線雙結(jié)法”結(jié)扎LVA。結(jié)扎成功的心電標(biāo)志為心電圖Ⅱ?qū)T段明顯抬高、R波降低、QRS波增寬及心率明顯變化等，結(jié)扎局部心肌明顯變色，活動減弱。

1.2.3 缺血再灌注的實施 結(jié)扎冠狀動脈30 min后，解開與血管平行放置的2-0線的活結(jié)，通過牽拉該縫線可迅速解開結(jié)扎冠狀動脈的單結(jié)，從而實現(xiàn)再灌注。

1.2.4 肌鈣蛋白I（cTnI）檢測 術(shù)前及再灌注2 h后，分別自兔股靜脈抽取1 ml靜脈血，2500 rpm離心15 min，取上清液，于-80℃冰箱內(nèi)保存，集中備檢。標(biāo)本檢測嚴(yán)格按照說明書操作（羊抗兔心臟肌鈣蛋白檢測試劑盒，ADL公司）。

1.2.5 心肌梗死面積檢測 再灌注2 h完成后，取出心臟生理鹽水洗凈，觀察冠狀動脈走行，稱左心室重量。將左心室橫切5片，置于1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中37℃水浴30 min，在10%甲醛中浸泡過夜。分離開蒼白色梗死心肌與磚紅色存活心肌，心肌梗死面積以梗死心肌重量與左室心肌重量的百分比表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，不同組間采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組動物手術(shù)情況 “六線六結(jié)”開胸法視野暴露清楚，出血較少，氣胸發(fā)生率低?！半p線雙結(jié)”法可以簡便實現(xiàn)心肌的缺血再灌注。常規(guī)組動物術(shù)中死亡1例，為麻醉過量，2例心電監(jiān)護(hù)、心肌肌鈣蛋白I及病理等提示無明顯心肌損傷，制模成功率70%（7/10）；觀察組術(shù)中死亡3例，2例為心室顫動，1例死于氣胸，余7例肌鈣蛋白I、病理均提示有明顯梗死，制模成功率70%（7/10）。

2.2 肌鈣蛋白I的變化 術(shù)前cTnI濃度兩組間無明顯差異；術(shù)后兩組cTnI均明顯升高（P＜0.05），B組術(shù)后cTnI升高更明顯，且變異小，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.061）。見表1、圖3。

表1 兩組術(shù)前及術(shù)后cTnI的比較（±s）

表1 兩組術(shù)前及術(shù)后cTnI的比較（±s）

注：與同組術(shù)前比較，aP＜0.05

cTnI（ng/ml）術(shù)前 術(shù)后2 h A 組 7 0.37±0.12 2.31±1.59aB 組 7 0.32±0.14 3.49±0.74a組別 例數(shù)

2.3 兔冠狀動脈走行及兩組心肌梗死面積比較在體及離體觀察冠狀動脈走行情況，發(fā)現(xiàn)LAD從左冠狀動脈起始約2 mm處分出，與靜脈伴行，比較短，肉眼難以辨識；而LVA則粗大，變異較小,肉眼可見，LVA與左緣靜脈呈交叉關(guān)系，結(jié)扎平面往往位于交叉點。TTC染色后可見蒼白的梗死區(qū)與磚紅色存活區(qū)分界明顯，B組梗死面積顯著大于A組（P=0.043），而且離散小。兩組的心梗面積等比較見表 2，圖 4。

3 討論

急性心肌梗死是當(dāng)前威脅人們生命健康的主要急危重癥，急診冠狀動脈介入、溶栓等心肌再灌注是治療的關(guān)鍵。但是再灌注損傷的存在降低了治療的效果[4,10]。建立穩(wěn)定有效的急性心肌缺血再灌注損傷模型，對深入研究其病理生理，從而優(yōu)化防治策略，有著極為重要的意義。兔心臟解剖生理特性與人類相近[1,5,6]，相對較大便于操作，而且左右胸腔各自具有獨立的胸膜，只要不損傷胸膜，暴露心臟時不需使用呼吸機，較為經(jīng)濟，故常被選用制作心肌缺血再灌注損傷模型。

表2 兩組左心室重量、梗死心肌重量及心梗面積比較（±s）

表2 兩組左心室重量、梗死心肌重量及心梗面積比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 左室重量（g） 梗死心肌重量（g） 心梗面積（%）A 組 7 3.24±0.14 0.69±0.26 21.51±7.87 B 組 7 3.26±0.17 0.94±0.18 28.95±6.59a

常用制模方法中，多以血管鉗鉗夾肋骨開胸止血，以拉鉤、開胸器等開放手術(shù)視野，硅膠管套環(huán)結(jié)扎前降支而實施缺血再灌注。這種方法存在出血過多、氣胸發(fā)生率高、冠狀動脈血流阻斷不徹底、梗死范圍不穩(wěn)定等不足，成功率在30%～60%[1-8]。我們在前期實驗中體會到，傳統(tǒng)實驗方法對操作技術(shù)要求較高，學(xué)習(xí)曲線長，因而探索改進(jìn)了開胸、冠脈結(jié)扎等方法，有效簡化了操作，提高了制模成功率。

我們采用的“六線六結(jié)”改良開胸法，把肋間動脈等血管和肋骨一起結(jié)扎，顯著減輕了術(shù)中的出血；采用牽拉六根縫線暴露手術(shù)視野，有效地避免了拉鉤等器械對胸膜的損傷，減少了氣胸的發(fā)生；而且在完成手術(shù)關(guān)閉胸腔時，再牽拉結(jié)扎離斷的肋骨兩端的縫線，使肋骨對位好，利于保持胸廓的正常形態(tài)，加快術(shù)后的恢復(fù)。

兔左冠狀動脈LAD較短，與心前大靜脈緊密伴行，血管難以辨認(rèn)，結(jié)扎時難以避開靜脈，制作的模型缺血面積變異大。LVA較LAD粗大，且變異較小，其與左緣靜脈呈交叉關(guān)系，結(jié)扎時只要避開交叉點，就能形成貧血性梗塞，這樣制做的模型更接近于人類[1,5,6]。我們的結(jié)果顯示，應(yīng)該優(yōu)選LVA結(jié)扎制備兔急性心肌缺血模型。

目前的缺血再灌注操作主要是通過將結(jié)扎血管的縫線兩端共穿一細(xì)硅膠管形成閉環(huán)，拉緊縫線用止血鉗固定導(dǎo)致心肌缺血，松開鉗子則使心肌得到再灌注，從而實現(xiàn)缺血再灌注[1,3,6]。該方法對細(xì)管的要求較高，太軟不能完全阻斷血流，太硬則容易損傷心肌[9]。我們發(fā)現(xiàn)其操作要求較高，用以阻斷LVA血流難度更大。我們使用本實驗室薛楓等[9]首創(chuàng)的“二線二結(jié)”法，通過第2根線所打活結(jié)使結(jié)扎血管的結(jié)不易松動，從而阻斷血流，完成缺血；牽拉該線后可以立即解開阻斷血管所打的結(jié)，簡便完成再灌注操作。

組織病理上常先以伊凡氏藍(lán)染色，分離正常與損傷心肌，再以TTC染色鑒別損傷與梗死的心肌。我們嘗試直接以TTC染色區(qū)分梗死心肌與存活心肌，以未著色的梗死心肌重量與左心室重量比表示心肌梗死的范圍。實驗結(jié)果表明，此方法簡潔、可行，有效節(jié)約了實驗成本。

我們體會到，采用“六線六結(jié)”開胸法可以顯著減少出血及氣胸的發(fā)生率，證實了本實驗室首創(chuàng)的“二線二結(jié)”可以簡便、完全地阻斷實驗兔的冠狀動脈血流，迅速實現(xiàn)再灌注。結(jié)扎LVA制備兔急性心肌缺血模型優(yōu)于常規(guī)LAD結(jié)扎法，直接以TTC染色區(qū)分梗死心肌與存活心肌，簡便可行。上述改良方法有效地提高了制模成功率，簡便可行，對初學(xué)者尤為實用，值得進(jìn)一步研究、推廣。

（本文圖片第768頁）

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Improvement in making ischemia and reperfusion model of rabbit’s heart

YU Zong-liang＊，CHEN Le，XU Hao-jun，et al.＊Department of Cardiology,Kunshan First People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan 215300，China

Objective The research is aimed at improving methods in making of heart ischemic/reperfusion model of rabbit.Methods 20 New Zealand rabbits were randomly allocated to 2 groups（n=10）followed the procedure of“6 sutures and 6 knots”method to open the chest.Left anterior descending artery（LAD，control group）or left ventricular artery（LVA，study group）were occluded for 30 min using the “2 sutures and 2 knots”method，respectively.The hearts were enucleated after 120 min reperfusion，and myocardial infarct size were determined.Bloods were drawn from femoral vein to evaluate cardiac troponin I（cTnI） values before operation and 120 min after reperfusion in both groups.Results Incidence of pneumothorax and hemorrhea were significantly reduced during operation in this research，and achievement ratios were 70%in the 2 groups.There was an obvious elevation of cTnI in blood after operation（control group:0.37±0.12 vs 2.31±1.59，P＜0.05.Study group：0.32±0.14 vs 3.49±0.74，P＜0.01）.The infarct size in LVA occlusion group was bigger than that of LAD group，with less variation furthermore（control group:21.51±7.87%.Study group:28.95±6.59%，P＜0.05）.Conclusion The new methods would improve achievement ratio of establishing ischemic/reperfusion model in rabbit’s heart.

Rabbit； Model； Ischemic/Reperfusion； Left ventricular artery

YU Zong-ling，E-mail：zl-yu@sohu.com

昆山市科技計劃項目（項目編號：KS2010002）

于宗良，E-mail：zl-yu@sohu.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.018

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2014）08-0736－03

2014-03-03）