低HDL-C者外周血白細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因表達(dá)及相關(guān)研究

仝其廣 陸尤 馬芙蓉 毛雯 張苗苗 王春玲 范煜東 吳迪 劉鵬 劉艷霞 胡大一

臨床研究

低HDL-C者外周血白細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因表達(dá)及相關(guān)研究

仝其廣 陸尤 馬芙蓉 毛雯 張苗苗 王春玲 范煜東 吳迪 劉鵬 劉艷霞 胡大一

作者單位：100028 北京市，煤炭總醫(yī)院心內(nèi)科（仝其廣、陸尤、馬芙蓉、毛雯、張苗苗、王春玲、范煜東、吳迪、劉鵬）；沈陽軍區(qū)總醫(yī)院干二科（劉艷霞）；北京大學(xué)人民醫(yī)院心臟中心（胡大一）

目的 研究低HDL-C患者外周血白細(xì)胞ABCA1和ABCG1 mRNA的表達(dá)狀態(tài)。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，測定外周血白細(xì)胞ABCA1和ABCG1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 低HDL-C患者ABCA1表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低（0.23±0.09比1.18±0.49，P=0.042），ABCG1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.09±1.08比 3.94±1.48，P=0.355）；低 HDL-C 者高敏 CRP（hs-CRP）水平明顯高于對(duì)照組（2.34±1.68比1.15±0.48，P=0.008）；血清 hsCRP 水平與 ABCA1 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.330，P=0.043），與血清 HDL-C水平無相關(guān)性（r=0.19，P=0.254）。多因素線性回歸分析表明，ABCA1 mRNA表達(dá)水平與血清hs-CRP水平呈邊緣性相關(guān)（β=-0.330，P=0.079）。結(jié)論 低HDL-C患者外周血ABCA1 mRNA表達(dá)水平降低，炎癥因素或許是其機(jī)制之一。這可能是低HDL-C者心血管病風(fēng)險(xiǎn)增高的一個(gè)因素。

低高密度脂蛋白膽固醇； 外周血白細(xì)胞； 基因表達(dá)； 膽固醇流出

低HDL-C是心血管病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。流行病學(xué)早已發(fā)現(xiàn)，血清HDL-C水平降低可引起冠心病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[1-4]。眾所周知，HDL是參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）的重要因子，通過HDL將外周組織（包括血管壁內(nèi)）的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝、排泄。這是目前認(rèn)為HDL發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵所在。ABCA1和ABCG1基因是RCT徑路中調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的關(guān)鍵因子，與HDL等細(xì)胞外受體協(xié)同作用，完成RCT的過程。低HDL-C患者RCT基因的表達(dá)如何，相關(guān)影響因素怎樣，目前尚少見報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇在煤炭總醫(yī)院住院或體檢的個(gè)體。其中低HDL-C組18例，男性15例，女性3例，平均年齡（64.33±5.53）歲；對(duì)照組 20 例，男性12例，女性 8例，平均年齡（65.8±15.65）歲。收集研究對(duì)象的基本資料、家族史、既往史、吸煙和飲酒史等。吸煙者定義為吸煙指數(shù)≥100支/年，且戒煙不超過2年。按照中國血脂異常防治指南定義低HDL-C標(biāo)準(zhǔn)為HDL-C＜1.04 mmol/L。

凡有下列情況者予以排除：急性心肌梗死或急性腦卒中、糖尿病、入院前或體檢前一個(gè)月內(nèi)服用他汀或其他降脂藥物、心力衰竭、嚴(yán)重肝腎功能損害、血液病、甲狀腺疾病、腫瘤、絕經(jīng)后用激素替代治療婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學(xué)指標(biāo)測定 清晨空腹（12 h）取靜脈血，按標(biāo)準(zhǔn)方法測定血脂、血糖、血清肌酐、尿素氮和高敏CRP（hs-CRP）等生化指標(biāo)。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因mRNA表達(dá)

1.2.2.1 RNA提取 清晨空腹取靜脈血（12 h）2 ml置入EDTA抗凝管，并加入RNA保存液中，-80℃冰箱保存，一周內(nèi)完成RNA提取。按照文獻(xiàn)方法提取外周血白細(xì)胞RNA[5]。所有標(biāo)本RNA均進(jìn)行純度、濃度和完整性檢驗(yàn)（圖1為提取RNA）。

1.2.2.2 基因表達(dá) 首先將白細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系（20 μl體系）：RNA 3 μl，5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，DEPC H2O 10.5。

逆轉(zhuǎn)錄程序：42℃保溫60 min。95℃ 5 min，4℃ 1～5 min，迅速放入-20℃長期凍存，統(tǒng)一進(jìn)行表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

熒光定量 PCR（反應(yīng)體系為 25 μl）：含基因組cDNA 1 μl，上游和下游引物分別為 5 pmol，dNTPmix 5 nmol，Taq 酶 1 U，Sybr Green 1（10×）1 μl及滅菌去離子水適量，應(yīng)用自動(dòng)循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃ 5 min。反應(yīng)循環(huán)為：變性94℃ 30 s，退火56℃～61℃ 30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸 10 min。基因mRNA表達(dá)以β-actin標(biāo)化。

引物：β-actin 上游引物 5’-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3’，下游引物 5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3’；ABCA1 基因，上游引物 5’-GGCTGTGTCTCGTATTGTCTG-3’，下游引物 5’-CCTTGTGGCTGGAGTGTCA-3’；ABCG1 上游引物5’-AGAAAGACTTTGAAAGAGTT-3’，下游引物 5’-GGTAAATCACATACTTTGTT-3’。

RNA提取、引物合成及熒光定量PCR均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。偏態(tài)分布轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布后再進(jìn)行分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，參數(shù)間單因素相關(guān)分析采用Pearson分析，線性回歸用于參數(shù)獨(dú)立相關(guān)分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 低HDL-C與對(duì)照組一般臨床資料（±s）

表1 低HDL-C與對(duì)照組一般臨床資料（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別 例數(shù) 年齡（歲） 男/女 體重指數(shù)（kg/m2） 高血壓（%） 飲酒（%） 吸煙（%）低 HDL-C 組 18 64.33±5.53 15/3 25.14±1.99 50.0 33.3a76.7a對(duì)照組 20 65.80±15.65 12/8 26.38±5.39 60.0 0.0 10.0

2 結(jié)果

2.1 低HDL-C組與對(duì)照組一般臨床資料比較 選擇低HDL-C組18例，對(duì)照組20例。兩組基礎(chǔ)資料比較發(fā)現(xiàn)，低HDL-C組吸煙和飲酒比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；而兩組年齡、男女比例、體重指數(shù)相近，高血壓患病比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 兩組臨床生化指標(biāo)比較 從表2可見，低HDL-C組血清HDL-C水平明顯低于對(duì)照組，hs-CRP水平則明顯高于對(duì)照組。兩組之間TC、TG和LDL-C濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腎功能指標(biāo)和血糖水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因mRNA表達(dá) 圖1為人外周血白細(xì)胞總RNA瓊脂糖電泳分析結(jié)果（28S和18S核糖體RNA），提示提取RNA完整性良好。由圖2、3可知，低HDL-C組兩個(gè)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因mRNA表達(dá)較對(duì)照組都呈降低趨勢，其中ABCA1基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 低HDL-C組與對(duì)照組生化指標(biāo)（±s）

表2 低HDL-C組與對(duì)照組生化指標(biāo)（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) TC（mmol/L）Cr（μmol/L）低 HDL-C 組 18 4.17±2.28 1.19±0.67 0.83±0.13a2.19±0.48 2.34±1.68 6.39±1.87 5.78±1.86 79.83±20.00對(duì)照組 20 4.08±1.07 1.68±2.06 1.36±0.17 2.24±0.97 1.15±0.48 5.62±0.55 5.58±2.18 68.54±28.91 TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）hs-CRP（mg/dL）BS（mmol/L）BUN（mmol/L）

圖1 人外周血白細(xì)胞RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 不同HDL-C水平組ABCA1 mRNA表達(dá)比較

圖3 不同HDL-C水平組ABCG1 mRNA表達(dá)比較

2.4 外周血細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因ABCA1 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析 對(duì)ABCA1 mRNA表達(dá)進(jìn)行單因素相關(guān)分析，結(jié)果顯示，ABCA1 mRNA表達(dá)水平與血清hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.330，P=0.043），與血清 HDL-C 水平無相關(guān)性（r=0.19，P=0.254）。多因素線性回歸分析表明，ABCA1 mRNA表達(dá)水平與血清hs-CRP水平呈邊緣性相關(guān)（β=-0.330，P=0.079）；吸煙是影響 HDL-C 水平的相關(guān)因素（β=-0.283，P=0.004）。

3 討論

低HDL-C是重要的心血管病危險(xiǎn)因素。HDL通過接受從巨噬細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)出的膽固醇發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出主要受ABCA1、ABCG1和SR-BI基因的調(diào)控。這些基因表達(dá)增強(qiáng)能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，防止細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究觀察到，低HDL-C患者ABCA1 mRNA的表達(dá)明顯降低，ABCG1表達(dá)雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低HDL-C患者伴有ABCA1膽固醇通路受損。這與Holven等[6]的報(bào)道相一致。該研究發(fā)現(xiàn)15例低HDL-C患者ABCA1 mRNA表達(dá)明顯降低。另一方面，白細(xì)胞ABCA1表達(dá)的抑制可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[7]。雖然本研究未能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后蛋白功能的探討，不過細(xì)胞膽固醇流出調(diào)控基因表達(dá)的減弱很可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積聚，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

外周血ABCA1 mRNA表達(dá)是否會(huì)影響血清HDL-C水平？進(jìn)一步分析資料未見血清HDL-C水平與ABCA1mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性，這表明外周血細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)對(duì)血清HDL-C水平無影響。文獻(xiàn)也報(bào)道，外周組織的巨噬細(xì)胞RCT基因表達(dá)對(duì)血漿HDL-C濃度影響甚微[8]，主要是肝細(xì)胞ABCA1等基因表達(dá)程度影響了血清HDL-C水平。本研究血清HDL-C水平與ABCA1表達(dá)無相關(guān)性也證實(shí)了這一點(diǎn)。肝臟ABCA1是apoA-I脂化的根本因素，是維持血漿HDL-C水平的決定因素[9]。外周血白細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)有可能影響細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，并沒有對(duì)血清膽固醇水平產(chǎn)生作用。

CRP作為一種炎癥標(biāo)志，也被認(rèn)為是心血管病的危險(xiǎn)因素。本研究中低HDL-C患者血清hsCRP水平較對(duì)照組明顯升高，HDL-C水平與hs-CRP處于低度負(fù)相關(guān)狀態(tài)。由于入選對(duì)象排除了感染、器官衰竭、腫瘤等情況，因此提示該部分病例體內(nèi)存在一定程度的炎性反應(yīng)。Wang等[10]在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察到CRP可抑制人巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇的流出。Li等[11]也發(fā)現(xiàn)CRP低調(diào)外周血單核細(xì)胞ABCA1和ABCG1的mRNA表達(dá)。本課題同樣表明，血清hsCRP水平與ABCA1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些都提示低HDL-C患者ABCA1 mRNA表達(dá)降低可能與炎癥有關(guān)。另外，有學(xué)者觀察到抑制小鼠巨噬細(xì)胞RCT可促進(jìn)細(xì)胞的炎癥表型[12]。同樣Holven發(fā)現(xiàn)，低HDL-C患者血清新碟呤（neopterin，一種炎性指標(biāo)）水平明顯升高，與之相伴隨的是患者外周血單核細(xì)胞ABCA1和ABCG1表達(dá)降低，而抗炎因子如脂聯(lián)素（adiponectin）缺乏能抑制ABCA1表達(dá)和ApoA-I合成[13,14]，因此低HDL-C患者體內(nèi)炎性因素增強(qiáng)，炎癥可影響膽固醇流出調(diào)控基因的表達(dá)。低HDLC有可能通過炎癥表型間接降低ABCA1表達(dá)?？梢?，低HDL-C、炎癥和ABCA1表達(dá)抑制存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。

脂質(zhì)學(xué)說和炎癥學(xué)說是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的兩個(gè)主要學(xué)說。顯然，低HDL-C患者存在血管保護(hù)性脂質(zhì)HDL的降低，細(xì)胞膽固醇流出調(diào)節(jié)基因表達(dá)降低所致細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚（致動(dòng)脈粥樣硬化作用增強(qiáng)），以及炎性因素的影響，這些都會(huì)顯著增高心血管病發(fā)病的危險(xiǎn)性。血清學(xué)因素、基因?qū)W水平、脂質(zhì)學(xué)因素和炎癥因素之間存在一定的聯(lián)系。盡管目前為止專門升高HDL-C水平的臨床試驗(yàn)仍未能獲得積極的結(jié)果，但是針對(duì)HDL的干預(yù)仍然是值得探討和努力的一個(gè)方向。

本研究也存在不足之處。如未檢測膽固醇流出調(diào)節(jié)基因蛋白水平的表達(dá)，沒有探討低HDL-C患者HDL相關(guān)基因是否存在基因變異問題等。不過，從本研究中顯示的吸煙對(duì)血清HDL-C水平的重要影響來看，研究病例存在HDL基因變異的可能性較小。

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Cholesterol efflux regulating gene expression in peripheral blood leukocytes and associated factors for subjects with low plasma HDL cholesterol levels

TONG Qi-guang＊，LU You，MA Fu-rong，et al.＊Department of Cardiology，Coal General Hospital，Beijing 100028，China

Objective To investigate ATP binding cassette transporters（ABCA1 and ABCG1）gene expression in peripheral blood leukocytes from subjects with low plasma HDL cholesterol levels.Methods Thirtyeight cases were enrolled，peripheral blood leukocytes ABCA1 and ABCG1 mRNA expression were measured by real-time quantitative PCR.Results ABCA1 mRNA expression in subjects with low plasma HDL cholesterol levels was obviously less than that in controls（0.23±0.09 vs 1.18±0.49，P=0.042），there was not different between two groups for ABCG1 mRNA expression（3.09±1.08 vs 3.94±1.48，P=0.355）.The serum hscrp concentration in subjects with low plasma HDL cholesterol levels was statistically greater than that in controls（2.34±1.68 vs 1.15±0.48，P=0.008），negatively associated with ABCA1 mRNA expression（r=-0.330，P=0.043），and not related to plasma HDL-C concentration （r=0.19，P=0.254）.Using multivariant linear regression analysis method,it was shown that ABCA1 mRNA expression was borderly associated with the serum hsCRP level（β=-0.330，P=0.079）.Conclusion ABCA1 mRNA expression in the peripheral blood leukocytes from subjects with low plasma HDL cholesterol levels was reduced，inflammation maybe a cause，and it is one probably factor to result in higher cardiovascular disease risk for these patients.

Low plasma HDL cholesterol； Peripheral blood leukocytes； Gene expression； Cholesterol efflux

首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金（項(xiàng)目編號(hào)：2007-3127）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.002

R54

A

1672-5301（2014）08-0677－04

2014-05-04）