HPLC法測定眼用伏立康唑納米結(jié)晶混懸液含量

戴助 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 荊州 434000)

眼部真菌感染是一種缺乏特異有效治療方法、嚴(yán)重威脅視力的眼部感染性疾病，臨床局部藥物治療缺乏敏感是該病治療失敗的主要原因［1］。伏立康唑作為新型第三代抗真菌藥對(duì)多種眼部致病真菌具有更強(qiáng)抗菌活性 (例如其體外抗菌活性是氟康唑的50～100倍)［2］，在臨床上有著不可替代的地位。為了解決伏立康唑的溶解性能、增加眼部用藥的生物利用度，本課題組前期構(gòu)建了穩(wěn)定的伏立康唑納米結(jié)晶混懸液。本文采用高效液相色譜法 (HPLC)測定此產(chǎn)品中伏立康唑含量，為下一步伏立康唑眼用制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

Dionex P680高效液相色譜儀:四元泵、紫外檢測器、Chromeleon色譜工作站 (美國);Hypersil C18色譜柱 (大連伊利特);伏立康唑?qū)φ掌?(批號(hào):090621)，0.5%伏立康唑納米結(jié)晶混懸液 (實(shí)驗(yàn)室制備);甲醇、乙腈 (ThermoFisher色譜純)，磷酸二氫銨、氨水均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參考HPLC測定伏立康唑的文獻(xiàn)［3-5］，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，確定流動(dòng)相為0.04mol/L磷酸二氫銨溶液 (用氨水調(diào)節(jié)pH值至6.0)-乙腈 (60∶40)，流速為1.0ml/min;色譜柱為Hypersil ODS C18色譜柱 (4.6mm×150mm，5μm)，進(jìn)樣量為20μl;取濃度為 20μg/ml的伏立康唑?qū)φ掌啡芤涸?90～450nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示在256 nm處伏立康唑有最大特征吸收，確定紫外檢測波長為256nm。

2.2 專屬性考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將伏立康唑?qū)φ掌泛头⒖颠蚣{米結(jié)晶混懸液樣品分別進(jìn)樣測得色譜圖(圖1)，從圖1可知對(duì)照品與樣品中伏立康唑主成分峰保留時(shí)間一致，樣品中雜質(zhì)峰對(duì)主成分峰無干擾，分離度大于3.0。

圖1 伏立康唑?qū)φ掌?(a)和伏立康唑納米結(jié)晶混懸液 (b)色譜圖

2.3 線性試驗(yàn)

精密稱定伏立康唑?qū)φ掌愤m量，采用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度配制成濃度為10mg/ml的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備 液 2.5、5、10、20、50、100、200、300μl 于10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以伏立康唑峰面積(A)對(duì)其濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=0.3289C+0.3699，R2=0.9998，線性范圍為2.5 ～200μg/ml。

2.4 干擾試驗(yàn)

為了考察納米結(jié)晶混懸液中輔料是否干擾伏立康唑的測定，取空白納米結(jié)晶混懸液適量加流動(dòng)相稀釋至一定濃度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖結(jié)果顯示納米結(jié)晶混懸液中輔料對(duì)樣品中伏立康唑含量測定沒有干擾。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取伏立康唑納米結(jié)晶混懸液樣品一定量，加流動(dòng)相稀釋20倍后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，以伏立康唑峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD為3.35%(n=5)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為200 μg/ml的伏立康唑?qū)φ掌啡芤喊础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，1日內(nèi)測定5次，以及每日測定1次，連續(xù)測定3d，得日內(nèi)與日間RSD值分別為2.28%和5.57%(n=5)。

2.7 回收率試驗(yàn)

用流動(dòng)相配制高、中、低三種濃度的伏立康唑?qū)φ掌啡芤?，按?.1”項(xiàng)下方法分別測定樣品中伏立康唑的含量，每組濃度平行操作3次計(jì)算平均回收率 (表1)。從表1可知低、中、高濃度回收率分別為98.15%、104.41%和96.41%，RSD分別為0.45%、0.56%和0.32%。

2.8 樣品含量測定

分別精密量取3個(gè)批號(hào)的伏立康唑納米懸浮液0.2 ml(約相當(dāng)于伏立康唑1 mg)，置于50 ml量瓶中加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中伏立康唑的含量，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 伏立康唑納米結(jié)晶混懸液含量測定

3 討論

在專屬性試驗(yàn)中，檢出伏立康唑納米結(jié)晶混懸液樣品雜質(zhì)對(duì)伏立康唑主成分峰的吸收沒有干擾。從HPLC系列方法學(xué)研究可見，該HPLC法簡便、快速、專屬性強(qiáng)，可用于伏立康唑納米結(jié)晶混懸液的含量測定。

［1］Shivaprakash MR，Apannanavar SB，Dhaliwal M，et al.Colletotrichum truncatum:an Unusual Pathogen Causing Keratitis and Endophthalmitis［J］.Clin Microbiol，2011，49(8):2894-2898.

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［3］中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典 (二部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

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［5］糜志遠(yuǎn)，石磊，張迎慶.高效液相色譜法測定伏立康唑膠囊含量研究［J］.湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(5):47-49.