NF-κB p50、NF-κB p65在甲狀腺癌中的表達及意義

秦陽，王玲，呂曉娟

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院普外科，遼寧沈陽110024；2.沈陽市兒童醫(yī)院醫(yī)?？?，遼寧沈陽110032；3.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院兒科，遼寧沈陽110024）

NF-κB p50、NF-κB p65在甲狀腺癌中的表達及意義

秦陽1，王玲2，呂曉娟3

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院普外科，遼寧沈陽110024；2.沈陽市兒童醫(yī)院醫(yī)?？疲|寧沈陽110032；3.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院兒科，遼寧沈陽110024）

目的探討NF-κB p50、NF-κB p65蛋白在甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達及二者與甲狀腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法采用免疫組織化學染色法檢測NF-κB p50和NF-κB p65蛋白在甲狀腺癌組（60例乳頭狀癌、20例濾泡癌和20例髓樣癌）及非甲狀腺癌組（30例健康者、30例甲狀腺腺瘤、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫）的甲狀腺組織的表達，并檢測NF-κB p50和NF-κB p65蛋白的表達的相關(guān)性。結(jié)果NF-κB p50蛋白在甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及健康者甲狀腺組織中的陽性率分別為73.00%、30.00%、33.33%及6.67%。NF-κB p50蛋白在甲狀腺非癌組織的陽性率明顯低于癌組織。NF-κB p65蛋白在甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及健康者甲狀腺組織中的陽性率分別為74.00%、36.67%、40.00%及10.00%。NF-κB p65蛋白在甲狀腺非癌組織的陽性率明顯低于癌組織。NF-κB p50蛋白在腫瘤直徑≥1.0 cm組及＜1.0 cm組的陽性率分別為79.41%和56.25%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NF-κB p65蛋白在腫瘤直徑≥1.0 cm組及＜1.0 cm組陽性率分別為94.12%和81.25%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為85.19%和87.04%；在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率分別為56.52%%和69.57%。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表達呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.712，P＜0.05）。結(jié)論NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白參與甲狀腺癌的表達，并于甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的協(xié)同作用。

甲狀腺癌；NF-κB p50、NF-κB p65；免疫組化

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，也是近年來普外科中的常見病，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢［1-2］。甲狀腺癌的病理類型有4種，分別為乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）、未分化型癌（undifferentiated thyroid carcinoma，UTC）和髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC），且甲狀腺癌以乳頭狀癌在臨床上較為多見［3-4］。目前對于甲狀腺癌的診斷方式較多，但是由于其形態(tài)不典型等原因而存在一定的誤診或漏診，因此應用分子生物學輔助診斷技術(shù)可以為其診斷和評估提供可靠的依據(jù)。NF-κB為一種蛋白因子，有研究表明［5-6］，NF-κB可通過持續(xù)活化而促進腫瘤細胞的增殖，降低其凋亡速度，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子而促進血管新生，誘導基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，并提高腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，因此NF-κB參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個環(huán)節(jié)。NF-κB p50、NF-κB p65參與了多種癌細胞的表達，且發(fā)揮著重要作用。故本實驗聯(lián)合檢測NF-κB p50、NF-κB p65在甲狀腺癌中的表達，為甲狀腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年2月～2014年2月沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院進行手術(shù)切除的甲狀腺組織的新鮮標本190例，其中甲狀腺癌標本100例，包括60例乳頭狀癌、20例濾泡癌和20例髓樣癌，另取30例健康者的甲狀腺組織，30例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織和30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織。納入標準：全部甲狀腺患者均經(jīng)確診，無其他嚴重的臟器類疾病，且所有患者手術(shù)前3周內(nèi)無任何放療治療。在100例甲狀腺癌標本中，男35例，女65例，年齡為15～78歲，平均年齡為（45.3±15.0）歲，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，腫瘤直徑≥1.0 cm者68例，腫瘤直徑＜1.0 cm者32例。本實驗獲得患者知情同意，并且得到倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑 電熱手提式壓力蒸汽滅菌器（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司），干燥箱（上海維菱科學儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），電子分析天平（北京京科瑞達科技有限公司），Olympus BH-2顯微鏡（日本Olympus公司），顯微照相儀（日本Olympus公司），超純水系統(tǒng)（德國賽多利斯集團）；兔抗人NF-κB p50克隆抗體（上海田源生物技術(shù)銷售部），兔抗人NF-κB p65多克隆抗體（上海田源生物技術(shù)銷售部），免疫組化染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），濃縮型DAB試劑盒（上海信譽科技有限公司），其余試劑均購自天津化學試劑三廠。

1.3 免疫組化染色 將本次實驗使用的所有標本組織離體后進行固定，乙醇梯度脫水并以石蠟包埋，冷凍后切成4μm的組織切片，加熱切片2 h后放入4℃的冰箱中保存。取出切片進行蘇木精-伊紅染色后嚴格按照免疫組織化學SP染色法的操作步驟進行免疫組織化學染色，以測得NF-κB p50，NF-κB p65蛋白在甲狀腺癌及非癌組織中的表達。對照組為NF-κB p50、NF-κB p65陽性表達的乳腺癌切片，且染色結(jié)果均為陽性，以含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性空白對照，且其染色結(jié)果均為陰性。

1.4 觀察指標 NF-κB p50，NF-κB p65的蛋白質(zhì)陽性信號主要表現(xiàn)在細胞質(zhì)和細胞核中，多為棕黃色顆粒，參考相關(guān)文獻［7-9］確定本次實驗的免疫組織化學染色結(jié)果判斷標準，顯微鏡下以400×觀察，對于著色細胞數(shù)評定：每觀察100個細胞中，著色細胞＜5個，為0分；著色細胞為5～25個，為1分；著色細胞26～50個，為2分；著色細胞＞50個，為3分。對于細胞質(zhì)或細胞核的評定：無色或稍微著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色或深黃色為2分，棕褐色或褐色為3分。將著色細胞數(shù)的評分與細胞質(zhì)（核）的評分的乘積定為每組染色的綜合評分，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為陽性，＞6分為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 釆用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對本次實驗數(shù)據(jù)進行分析，樣本率的比較采用卡方檢驗，各因素間的相關(guān)性分析應用Spearman等級相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白的表達 NF-κB p50蛋白在100例甲狀腺癌組織的陽性率為73.00%，呈高表達現(xiàn)象，在30例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織和30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織的陽性率分別為30.00%和33.33%，呈低表達現(xiàn)象。而在30例健康者的甲狀腺組織的陽性率為6.67%，呈極低表達現(xiàn)象。NF-κB p50蛋白在甲狀腺非癌組織的陽性率顯著低于癌組織（見表1）。

表1 NF-κB p50蛋白在4種組織中的表達情況Tab.1 Expression of NF-κB p50 protein in the case of the four tissues

NF-κB p65蛋白在100例甲狀腺癌組織的陽性率為74.00%，同樣呈高表達現(xiàn)象，在30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織和30例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織的陽性率分別為36.67%和40.00%，表達率相對較低。而在30例健康者的甲狀腺組織的陽性率為10.00%，同樣為極低表達現(xiàn)象。NF-κB p65蛋白在甲狀腺非癌組織的陽性率顯著低于癌組織（見表2）。

表2 NF-κB p65蛋白在4種組織中的表達情況Tab.2 Expression of NF-κB p65 protein in the case of the four tissues

2.2 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白在不同甲狀腺癌病理參數(shù)中的表達 以患者腫瘤直徑的長度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否進行分組，比較NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表達在各組的陽性率表達情況，經(jīng)χ2檢驗，NF-κB p50蛋白在腫瘤直徑≥1.0 cm組和腫瘤直徑＜1.0 cm組陽性率分別為79.41%和56.25%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），NF-κB p50蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率為85.19%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率為56.52%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。NF-κB p65蛋白在腫瘤直徑≥1.0 cm組和腫瘤直徑＜1.0 cm組陽性率分別為94.12%和81.25%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率為87.04%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率為69.57%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4）。

表3 NF-κB p50蛋白在不同甲狀腺癌病理參數(shù)中的表達Tab.3 Expression of NF-κB p50 proteins in different pathological parameters of thyroid cancer

表4 NF-κB p65蛋白在不同甲狀腺癌病理參數(shù)中的表達Tab.4 Expression of NF-κB p65 proteins in different pathological parameters of thyroid cancer

2.3 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表達的相關(guān)性 在甲狀腺癌的陽性率表達中，NF-κB p50蛋白陽性表達有73例，NF-κB p65蛋白陽性表達有74例，2者在甲狀腺癌的陽性表達中的符合率為95.65%（73／74）；NF-κB p50蛋白陰性表達有27例，NF-κB p65蛋白陽性表達有26例，2者在甲狀腺癌的陰性表達中的符合率為92.30%（26／27）；經(jīng)spearman等級相關(guān)分析，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表達呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.712，P＜0.05）。

3 討論

NF-κB是一種存在于真核細胞中的重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它不僅參與DNA的轉(zhuǎn)錄和啟動，還與免疫炎癥反應密切相關(guān)，是人體正常生命活動中的必要因子。研究表明［10-12］，NF-κB與人體的惡性腫瘤如食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多種癌癥密切相關(guān)。NF-κB不僅可以促進腫瘤細胞的增殖與分化，還在腫瘤血管的生成中起到促進作用。在人體內(nèi)，p50和p65是NF-κB家族中最為重要的兩個因子，且2者多以二聚體的形式存在于激活后的細胞質(zhì)或細胞核中，當機體免疫應答異常時，NF-κB不能及時恢復到原有的狀態(tài)而停留在細胞核中，從而改變了機體的正常應答信號而致使細胞癌變。

在本次實驗中，采用免疫組化法檢測了NF-κB p50蛋白在100例甲狀腺癌組織、30例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織和30例健康者的甲狀腺組織中的陽性率表達情況，結(jié)果顯示NF-κB p50蛋白的陽性率分別為73.00%、30.00%、33.33%和6.67%，NF-κB p50蛋白在甲狀腺非癌組織的表達率顯著低于癌組織。這與其他學者［11-14］在肝癌、胃癌和腺癌中的檢測結(jié)果類似，這就提示NF-κB p50蛋白的高表達與甲狀腺癌密切相關(guān)。分析其作用機制可能為NF-κB控制著凋亡細胞因子的表達，從而誘導其相關(guān)因子的生成抑制凋亡，此外，NF-KB也與TNF-α存在著正反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，故其可以致使細胞調(diào)節(jié)失控從而誘發(fā)癌變。

同法檢測了NF-κB p65蛋白在100例甲狀腺癌組織、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、30例甲狀腺腺瘤患者的甲狀腺腺瘤組織和30例健康者的甲狀腺組織中的陽性率分別為74.00%、36.67%、40.00%和10.00%，NF-κB p65蛋白在甲狀腺非癌組織顯著低于癌組織。本次實驗結(jié)果與Sasaki N［15］等在40例非小細胞肺癌患者的腫瘤組織切片中的檢測結(jié)果一致，提示NF-κB p65蛋白高表達對甲狀腺良惡性病變的鑒別與檢測存在著一定臨床意義，但需要進行大樣本的研究與分析。

在甲狀腺癌的表達中，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在陽性表達中的符合率為95.65%（73／74），在陰性表達中的符合率為92.30%（26／27），經(jīng)spearman等級相關(guān)分析，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表達呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.712，P＜0.05）。這就提示2種蛋白之間的協(xié)同關(guān)系同甲狀腺癌癥細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移存在著密切關(guān)系。在本次研究的前提下，可以再通過進行Kaplan-Meier生存曲線，來分析這2種蛋白與甲狀腺癌的預后之間的關(guān)系，為后續(xù)研究NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在甲狀腺癌預后的風險評估奠定基礎(chǔ)并提供重要的參考數(shù)據(jù)。

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（編校：譚玲）

Expression and significance of NF-κB p50 and NF-κB p65 in thyroid cancer

QIN Yang1，WANG Ling2，LV Xiao-juan3

（1.Department of General Surgery，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang 110024，China；2.Department of Medicare，Children's Hospital of Shenyang，Shenyang 110032，China；3.Department of Pediatrics，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the expression of NF-κB p50 and NF-κB p65 protein in thyroid cancer，thyroid adenoma，nodular goiter and normal thyroid tissues，and the role of NF-κB p50，NF-κB p65 protein in infiltration and metastasis of thyroid cancer.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression NF-κB p50 and NF-κB p65 protein in thyroid tissue in thyroid cancer group（60 cases of papillary carcinoma，20 cases of follicular carcinoma，20 cases ofmedullary carcinoma）and non-cancerous group（30 cases of healthy thyroid，30 cases of thyroid adenoma，30 cases of nodular goiter），and correlation of expression between NF-κB p50 and NF-κB p65 protein.ResultsIn thyroid tissues of 100 patients with thyroid cancer，the positive rate of NF-κB p50 protein expression was 73.00%；in thyroid tissues of 30 patients with thyroid adenoma and 30 patients with nodular goiter，the positive ratewere 30.00%and 33.33%respectively；in thyroid tissues of30 healthy people，the positive rate was6.67%，the positive rate of NF-κB p50 protein expression in thyroid non-cancerous tissueswas significantly lower than that of thyroid cancer tissue.In thyroid tissues of100 patientswith thyroid cancer，the positive rate of NF-κB p65 protein expression was74.00%；in thyroid tissues of30 patientswith thyroid adenoma and 30 patients with nodular goiter，the positive rate were 36.67%and 40.00%respectively；in thyroid tissues of 30 healthy people，the positive rate was 10.00%.The positive rate of NF-κB p65 protein expression in non-cancerous tissues was significantly lower than that of thyroid cancer tissue.In tumor diameter≥1.0 cm group and tumor diameter＜1.0 cm group，the positive rate of NF-κB p50 protein expression were 79.41%and 56.25% respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；in tumor diameter≥1.0 cm group and tumor diameter＜1.0 cm group，the positive rate of NF-κB p65 protein expression was 94.12%and 81.25%respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The positive rate of NF-κB p50 protein and NF-κB p65 protein in lymph nodemetastasis group were85.19%and 87.04%，respectively；the positive rate in the group without lymph node metastasis were 56.52%%and 69.57%，respectively.The differences were statistically significant（P＜0.05）.The correlation of expression between NF-κB p50 protein and pNF-κB p65 positive was positive（r＝0.712，P＜0.05）.Conclusion NF-κB p50 protein andNF-κB p65 protein are involved in the expression of thyroid cancer，and play an important synergetic role in the occurrence and development of thyroid cancer.

thyroid cancer；NF-κB p50，NF-κB p65；immunohistochemistry

R653

A

1005－1678（2014）08－0148－04

秦陽，男，碩士，副主任醫(yī)生，研究方向：普外科，E-mail：qy15989350322＠163.com。