順鉑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型VEGF及TNF-α的影響

肖麗，李坤

（1.山東省交通醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南250031）

順鉑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型VEGF及TNF-α的影響

肖麗1，李坤2

（1.山東省交通醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南250031）

目的觀察順鉑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-α）的影響。方法采用自體子宮移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，將行假手術(shù)的大鼠作為正常對照標(biāo)準(zhǔn)，將建模成功的大鼠隨機分為模型組、治療組與對照組，觀察異位病灶的形態(tài)特點，在光鏡下分析治療組治療前后的病理特點，檢測不同方法處理后異位病灶腹腔液中VEGF、TNF-α的濃度變化。結(jié)果治療組治療后異位病灶的上皮細(xì)胞明顯變薄，間質(zhì)細(xì)胞和腺體明顯減少，腺體樣結(jié)構(gòu)增大；模型組異位病灶腹腔液VEGF、TNF-α的濃度顯著高于假手術(shù)組，且具有顯著性差異（P＜0.05）；治療組異位病灶腹腔液VEGF、TNF-α的濃度顯著低于模型組，且有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥大鼠注射順鉑后，異位病灶腹腔液中VEGF、TNF-α的濃度明顯降低，異位病灶中炎癥細(xì)胞被抑制生長，異位病灶腹腔的微環(huán)境得到改善。

順鉑；子宮內(nèi)膜異位癥；大鼠模型；VEGF；TNF-α

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT），又稱異位癥，指的是有生長能力的子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜異位的部位種植和生長，是婦科常見的良性病變和多發(fā)?。?］。EMT主要的臨床癥狀包括繼發(fā)性痛經(jīng)、盆腔炎、盆腔包塊、月經(jīng)失調(diào)、不孕癥等［2］。EMT具有類似惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，嚴(yán)重威脅女性的生殖和健康。近年來，EMT的發(fā)病率呈逐年增長的趨勢［3］。而目前對該病的治療尚無金標(biāo)準(zhǔn)［4］。本研究通過建立SD大鼠EMT模型，分組比較，觀察順鉑對EMT模型大鼠腹腔液中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10周齡SD（Sprague-Dawley）大鼠，雌性，性成熟，未交配，清潔級，體質(zhì)量230～300 g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20℃～24℃，濕度40%～60%，自然飼養(yǎng)，SPF級環(huán)境，12 h明暗交替。由河北省實驗動物中心提供。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 儀器和試劑 順鉑注射液（南京制藥廠有限公司），普朗DNM-9602酶標(biāo)儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司提供），VEDF免疫組化及蛋白印跡試劑盒（Santa Cruz），TNF-α檢測試劑盒（上海威奧生物科技有限公司），高速臺式離心機GT10-1（北京時代北利離心機有限公司），THZ-82A型氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立 實驗大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，于最后2天，每天給予大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1mg／kg觀察動情周期。1周后行進行陰道脫落細(xì)胞涂片檢測，選取2個以上連續(xù)正常動情周期的大鼠作為實驗對象，隨機將其分為模型組（40只）和假手術(shù)組（10只）。模型組建立EMS大鼠模型，采用自體移植法。手術(shù)時，首先注射2%戊巴比妥鈉1mL／kg使大鼠完全麻醉，將其固定于操作板上，剪去腹部毛發(fā)，酒精消毒。切開腹部找到子宮，同時使左側(cè)子宮暴露在外。分離附著于卵巢附近約1 cm處子宮肌壁的結(jié)締組織和脂肪，用手術(shù)線結(jié)扎兩端。剪下中間長約1 cm的子宮，放于盛有生理鹽水的盤中，找到管狀子宮腔并縱向剖開，使子宮內(nèi)膜顯露出來，切取子宮壁塊，大小約4mm×4mm。在腹壁切口右側(cè)腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，使其能正好進入子宮壁塊，將切好的子宮壁塊平整地置入隧道底部，內(nèi)膜面需緊貼腹肌，逐層連續(xù)縫合腹部切口，使切口封閉，最后縫合腹腔。假手術(shù)組按照前述方法切取子宮組織，棄用，關(guān)閉腹腔，剩余操作以上相同，作為正常對照。手術(shù)后，給予各大鼠腹腔注射青霉素16萬U／kg，連續(xù)5 d。手術(shù)后第2天，為促進移植子宮內(nèi)膜生長，給予各大鼠注射雌二醇0.1mg／kg，每4天1次，共3次。假手術(shù)組肌肉注射等量的生理鹽水。正常飼養(yǎng)，待術(shù)后21 d，采用戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，固定于操作板上，切開腹腔，仔細(xì)觀察異位內(nèi)膜成膜情況。采用游標(biāo)卡尺測量異位內(nèi)膜長寬高度，計算其體積，如增大的體積大于8mm3，并伴集聚有大量液體，出現(xiàn)透明小囊狀，則表示建模成功。

1.3.2 模型大鼠分組及給藥 選取上述進行建模成功的大鼠30只（4只麻醉致未成活，6只未建模成功，建模成功率為75%），隨機分為模型組、治療組、對照組，每組各10只大鼠。對照組，給予0.9%氯化鈉液10mL腹腔灌注；治療組，給予順鉑注射液2mg／kg加蒸餾水2mL腹腔灌注；模型組、假手術(shù)組，不做任何處理；各組均常規(guī)飼養(yǎng)，需灌藥的每天1次，連續(xù)灌藥30 d。30 d后，禁食12 h，完全麻醉大鼠，切開腹腔，迅速剪取異位病灶處囊泡病灶組織，假手術(shù)組則切取子宮內(nèi)膜組織，將切取下來的組織用高溫滅酶鋁箔紙密封包裹，置于－80℃環(huán)境中凍存，待測量異位病灶大小。吸取少量異位病灶腹腔液分別置于標(biāo)記的無菌離心管中。離心機設(shè)置轉(zhuǎn)數(shù)為3000 r／min，離心20min，取離心后管中上清液，置于－20℃速凍保存，待檢測其VEGF和TNF-α的濃度。

1.3.3 實驗指標(biāo)及檢測方法 采用雙抗體夾心ELISA法檢測，操作方法參照ELISA試劑盒說明書，得到吸光度OD值，再運用CVXPT 32軟件包計算出濃度值，得到腹腔液VEGF和TNF-α的濃度；

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組病灶觀察 建模成功后的大鼠異位內(nèi)膜體積增大，有大量液體聚集，出現(xiàn)隆起的小囊泡，囊泡有血管及結(jié)締組織覆蓋，且血管較豐富，清晰可見（見圖1）。

圖1 建模成功后的大鼠治療前子宮內(nèi)膜異位病灶Fig.1 Endometriosis lesions ofmodel rats before treatment

治療前對治療組異位病灶進行病理分析，如圖所示，以異位內(nèi)膜上出現(xiàn)子宮內(nèi)膜組織的間質(zhì)細(xì)胞或者上皮細(xì)胞作為模型的標(biāo)準(zhǔn)。異位內(nèi)膜腔內(nèi)含有炎細(xì)胞及分泌物。與假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜的腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)面的上皮、固有膜和固有膜基質(zhì)細(xì)胞，腺體樣結(jié)構(gòu)與之相似。治療后治療組大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶病理分析。如圖所示，異位病灶的上皮細(xì)胞顯著變薄，間質(zhì)細(xì)胞和腺體顯著減少，腺體樣結(jié)構(gòu)增大（見圖2）。

圖2 治療前后治療組大鼠子宮內(nèi)膜異位病灶病理分析（HE，×10）Fig.2 Clinicopathologic analysis of endometriosis lesions ofmodel rats in treatment group before and after treatment（HE，×10）

2.2 腹腔液VECF和TNF-α濃度比較 模型組異位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的濃度顯著高于假手術(shù)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組異位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的濃度與模型組對比，無明顯差異性；治療組異位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的濃度顯著低于模型組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 腹腔液VECF和TNF-α濃度比較Tab.1 The concentrations of VECF and TNF-αin peritoneal fluid

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種具有類似惡性腫瘤生長特性的婦科常見良性病變。研究顯示，子宮內(nèi)膜的異位生長需通過血管新生、粘附與侵襲完成［5-6］。VEGF具有促進血管新生的作用，EMT患者異位病灶腹腔液中VEGF mRNA表達(dá)顯著高于正常婦女［7］，因此VEGF的含量與子宮內(nèi)膜異位癥的形成有重要關(guān)系［8］。此外，TNF-α與VEGF能協(xié)同促進病灶內(nèi)膜新生血管的生長。EMT患者與非子宮內(nèi)膜異位癥患者相比，腹腔液中VEGF、TNF-α含量差別較大，故可作為子宮內(nèi)膜異位癥的診斷及治療的靶點研究［9］。已知順鉑能干擾細(xì)胞DNA合成，促使內(nèi)膜凋亡，從而抑制增生，對人體增生性組織有顯著的抑制作用［10］。因此本文選取順鉑對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠進行治療，通過分析大鼠腹腔液中VEGF、TNF-α改變情況，評價順鉑的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，采用自體移植法建立的EMT大鼠模型，腹腔液中VEGF及TNF-α水平升高，這與張名香等［11］及李春霞等［12］報道的子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)VEGF水平一致。注射順鉑后，內(nèi)膜組織的上皮細(xì)胞變薄，間質(zhì)細(xì)胞和腺體減少伴腺體樣結(jié)構(gòu)增大，說明順鉑抑制了細(xì)胞生長；順鉑能降低異位病灶腹腔液中VEGF及TNF-α濃度，因此能抑制異位病灶中炎癥細(xì)胞生長。李嘉等［13］報道，采用順鉑腹腔灌注治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位病灶后，病灶體積明顯縮小，腹腔液VEGF與TNF-α濃度明顯降低，該結(jié)論與本次研究結(jié)果相符。喬慶等［14］稱，EMT大鼠腹腔液中TNF-α含量升高，順鉑腹腔灌洗可能通過降低腹腔液中TNF-α的含量，對EMT起到了一定治療作用。此外，多項研究從子宮內(nèi)膜異位癥其他腹腔液標(biāo)記物水平改變情況證實了順鉑對EMT的治療作用。王靚等［15］稱，順鉑腹腔灌洗能顯著降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）的含量，改善腹腔微環(huán)境來進一步抑制異位子宮內(nèi)膜的種植、生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

綜上所述，順鉑可能通過降低VEGF及TNF-α的水平來抑制子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶中血管新生，對臨床上用于治療EMT，減少血管增生和降低侵襲等生理過程有著重要研究意義。

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（編校：譚玲）

Effect of cisplatin on VEGF and TNF-αlevels in endometriosismodel rat

XIAO Li1，LIKun2

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Traffic Hospital of Shandong Province，Ji'nan 250031，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250031，China）

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin on vascular endothelial growth factor（VEGF）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）of uterus endometriosis ratmodel.MethodsAutologous transplantation of uterine was used to build uterus endometriosis ratmodel.The sham surgery rats were treated as normal control group，and themodeling successful ratswere randomly divided intomodel group，treatment group and control group.The ectopicmorphological characteristics of the lesion were observed，the pathological features under the lightmicroscope were analysed before and after treatment，and the concentration change of VEGF and TNF-αwere detected under different treatment of ectopic foci in peritoneal fluid.ResultsAfter treatment，the epithelial cells of ectopic lesion in treatment group were significantly thinner.The stromal cells and glandswere significantly reduced，and the glandular-like structurewere increased.The concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus in model group were significant higher than sham-operated group（P＜0.05）.The concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus in treatment group were significantly lower than model group（P＜0.05）.Conclusion After injection of cisplatin，the concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus of ratwith uterus endometriosis could be significant reduced.The growth of inflammatory cells in ectopic focus could be inhibited and the microenvironment of ectopic lesions abdominal cavity be improved.

cisplatin；uterine endometriosis；ratmodel；VEGF；TNF-α

R711

A

1005－1678（2014）08－0099－03

山東省自然科學(xué)基金課題項目（ZR2009CL027）；濟南市科技局科技明星計劃課題項目（20100118）；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金課題項目（201023）

肖麗，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制及診療，E-mail：qch1821460022＠163.com。