包裹多肽二氧化硅納米顆粒的制備和性能研究

郭豐義，沈玉蓮，吳勝本，張鵬輝

（1.濱州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濱州256610；2.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，重慶400016）

包裹多肽二氧化硅納米顆粒的制備和性能研究

郭豐義1，沈玉蓮1，吳勝本1，張鵬輝2

（1.濱州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濱州256610；2.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，重慶400016）

目的研究在不同鈣離子存在條件下二氧化硅的性質(zhì)和對蛋白包裹能力有無變化，來確定其是否有作為口服載體的性能。方法研究包裹多肽二氧化硅納米顆粒的制備、包裹多肽二氧化硅納米顆粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)、包裹不同多肽的二氧化硅納米顆粒的表征、包裹含有不同量的氯化鈣和不同結(jié)構(gòu)的多肽二氧化硅納米顆粒性能。結(jié)果以含有His標(biāo)簽的增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhance green fluorescent portein，EGFP；PI5.99）為模型，采用反相微乳液體系中加入適量氯化鈣，鈣離子既和二氧化硅納米粒子內(nèi)部的氧原子形成離子鍵，又和His標(biāo)簽形成絡(luò)合作用，這樣就將蛋白質(zhì)固定在二氧化硅納米粒子內(nèi)部，經(jīng)過多次洗滌泄露較少。酶切、加熱、尿素變性等試驗(yàn)均顯示其具有良好的穩(wěn)定性。結(jié)論通過在傳統(tǒng)的反相微乳液體系中加入適量的鈣離子，就可以達(dá)到良好的包裹效果，且其在酸性條件下不易釋放，而在堿性條件則相對容易釋放，符合用于口服藥物載體的基本要求。

納米二氧化硅；藥物口服系統(tǒng)；蛋白質(zhì)和多肽

二氧化硅納米顆粒作為藥物載體在藥物的裝載和釋放中有很多的優(yōu)勢，然而，其能否有效的載帶目的藥物到達(dá)目的組織尚不清楚［1］。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種簡單、有效包裹蛋白的方法，利用鈣離子很容易和帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，將蛋白成功地固定在二氧化硅納米粒子內(nèi)核中。本文實(shí)驗(yàn)中用相似的方法包裹一些多肽和蛋白，研究在不同鈣離子存在條件下二氧化硅的性質(zhì)和對蛋白包裹能力有無變化，另外還研究被二氧化硅納米顆粒包裹的蛋白和多肽在模擬體液pH環(huán)境下的釋放情況，來確定其是否有作為口服載體的性能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 試劑：正硅酸乙酯（TEOS）GR 500mL；胃蛋白酶＞99%，25 g，BSA AR 25 g，Triton X-100 GR 500 mL，均來自Sigma-Aldrich；正己醇AR 500mL，環(huán)己烷AR 500mL，氯化鈣AR 500 g，磷酸一氫鈉AR 500 g，磷酸二氫鈉AR 500 g，磷酸AR 500mL，丙酮AR 500mL，乙醇AR 500mL，碳酸鈉AR 500 g，碳酸氫鈉AR 500 g，氨水GR 500mL均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Peptide 1＞95%，50 mg，F(xiàn)ITC-HHHHHH＞98%，50 mg，F(xiàn)ITC-GDDHHHHHH＞98%，50 mg，F(xiàn)ITC-GDDDHHHHHH＞98%，50mg，F(xiàn)ITC-GDDYHHHHHH＞95%，50 mg，均來自上海科肽生物科技有限公司。

儀器：紫外-可見分光光度計(jì)HITACHIU-3010，Japan；熒光分光光度計(jì)HITACHI F-7000，Japan；BET儀Quadrasorb SI system，美國康塔；元素分析儀PE2400ⅡPerkin Elmer，American；透射電子顯微鏡（TEM）JEM 200CX JEOL，Japan；高倍透射電鏡（HRTEM）JEM-2010F JEOL，Japan；X射線衍射儀（XRD）D／Max-2000日本理學(xué)公司；高速冷凍離心機(jī)HITACHI CR21GⅡ，Japan；真空干燥箱DZF-6030A一恒科學(xué)儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A一恒科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器RO15德國IKA；搖床Forma Orbital Shaker Thermo Fisher。實(shí)驗(yàn)用水均為Barnstead Thermolyne Nanopure超純水系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 包裹多肽二氧化硅納米顆粒的制備 采用反相微乳液法制備包裹不同序列的多肽的二氧化硅納米顆粒，其具體合成方法如下：將環(huán)己烷7.5 mL、表面活性劑Triton X-100 1.8 mL和正己醇1.8mL混合均勻，加入300μL的2mg／mL含有不同濃度氯化鈣的水溶液作為反應(yīng)的內(nèi)核材料，常溫下磁力攪拌1 h，再將100μL TEOS加入到微乳液體系中，再保持磁力攪拌30min，加入60μL氨水，保持?jǐn)嚢?4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用20mL丙酮破乳、離心分離顆粒，再分別用適量乙醇和pH 2 PBS清洗數(shù)次。

1.3 包裹多肽二氧化硅納米顆粒的體外釋放實(shí)驗(yàn) 將含有不同濃度氯化鈣的包裹不同多肽的二氧化硅納米顆粒分裝在n（n為4組不同pH值的實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間點(diǎn)數(shù)值之和）等分的2mL Eppendorf管中，分別用1 mL（pH 2、pH 5、pH 7、pH 8）的磷酸鹽緩沖溶液溶解，將其放在搖床上于37℃、200 r／min條件下進(jìn)行釋放。每隔一定時(shí)間，每組pH取出一個(gè)Eppendorf管離心，棄去固體二氧化硅納米顆粒，保留上清液。所有時(shí)間點(diǎn)均取完后，將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上清液100μL溶解在900μL的pH 7.4的PBS中，用熒光分光光度計(jì)檢測上清液中的多肽的量。

1.4 包裹不同多肽的二氧化硅納米顆粒的表征

1.4.1 透射電鏡表征：將包裹各種多肽藥物的二氧化硅納米顆粒用乙醇溶解，將其懸浮液分別滴加在普通銅網(wǎng)上，在鼓風(fēng)干燥箱中干燥5 min使樣品干燥，通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和高倍透射電子顯微鏡（high resolution transmission electron microscopy，HRTEM）觀察拍照。

1.4.2 BET表征：納米材料的表面特征通常采用2個(gè)指標(biāo)來表征：比表面積和孔徑分布。比表面積是指單位質(zhì)量粉體的總表面積，孔徑分布是指粉體表面積體積隨孔尺寸的變化。對納米材料而言，其顆粒尺寸很小，比表面積和尺寸不可能直接測量，必須借助一些特別的測量工具，氮吸附法可以借助氮分子為標(biāo)尺來測量材料的表面積和表面的孔容積，從而表征納米材料。

1.4.3 XRD表征：X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）是通過對材料進(jìn)行X射線衍射分析其衍射圖譜，獲得材料的成分、材料內(nèi)部原子或分子的結(jié)構(gòu)等信息的研究手段。其中廣角X射線衍射（wide angle X-ray diffraction，XRDX）主要是對照標(biāo)準(zhǔn)譜圖分析納米粒子的組成、粒徑、結(jié)晶度等。X射線小角度散射（small angel X-rays scattering，SAXA）是發(fā)生在原光束附近從1～100 nm范圍內(nèi)的相干散射現(xiàn)象。

1.5 包裹含有不同量的氯化鈣和不同結(jié)構(gòu)的多肽二氧化硅納米顆粒性能研究

1.5.1 包裹多肽二氧化硅納米顆粒穩(wěn)定性考察：將制備的FITC-GDDHHHHHH＠SNPs在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，在干燥器中放置90 d后，用熒光分光光度計(jì)檢測干燥前后熒光的變化。結(jié)果顯示放置90 d后，熒光強(qiáng)度為新配置的77.4%，由此可知二氧化硅納米顆粒能夠有效保護(hù)熒光FITC，可間接推測出納米二氧化硅可有效保護(hù)多肽。

1.5.2 納米二氧化硅顆粒的載藥量測定：載藥量＝顆粒中藥物的含量／稱取的顆粒的質(zhì)量×100%，由于希望精確的知道二氧化硅中多肽的含量。將制備的FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，用元素分析測得N%為2.87%，從而計(jì)算得到多肽的含量為16.39%

1.5.3 納米二氧化硅納米顆粒的多肽包裹率：包裹率＝載藥顆粒上的藥物量／實(shí)際投藥量×100%［2-5］。由于有些載體對藥物的包裹率可能會(huì)隨著投入藥物濃度的不同而有所不同。本實(shí)驗(yàn)中的測量條件盡可能的會(huì)控制一致。通過藥物加入前后的熒光值變化量來計(jì)算包裹率。

2 結(jié)果

2.1 電子顯微鏡表征 如圖1所示，其中A和沒有包裹任何物質(zhì)的二氧化硅的形態(tài)最像，因此可知其包裹量最?。籅、C、F可能由于結(jié)構(gòu)相似，其TEM照片也很相似，顯示良好的包裹能力，相較A來看可能是由于氨基酸 D的絡(luò)合作用增強(qiáng)包裹能力；D分子是在A分子上接了BSA，其TEM照片顯現(xiàn)出雜亂的狀況，可能是由于BSA的分子比較大，纏繞在納米粒子周圍而不是被包埋在其粒子內(nèi)的緣故；E也顯示良好的包裹能力，則可能也是其分子中His和氨基酸D共同絡(luò)合的作用。

圖1 在0.2 M鈣離子存在條件下二氧化硅納米粒子包裹多肽的電鏡圖Fig.1 Electron micrographs of silica nanoparticles encapsulating polypeptide under 0.2M calcium ion

2.2 BET表征 BET測試結(jié)果表明，二氧化硅納米顆粒樣品是多孔材料，且孔徑直徑一般小于15 nm（見圖2）。

圖2 含有不同濃度鈣離子制備出的二氧化硅納米顆粒的BET表征圖Fig.2 The BET phenogram of silica nanoparticles in the presence of different concentration calcium ion

2.3 XRD表征 制備出來的二氧化硅納米顆粒都是無定型的。無鈣離子存在下的二氧化硅納米顆粒的小角X射線衍射圖譜所示有2個(gè)峰a和b，其中a可能是機(jī)器自身的誤差所致，而b則是孔徑的衍射峰［6-7］（見圖3）。

圖3 無鈣離子存在下的二氧化硅納米顆粒的小角X射線衍射圖譜Fig.3 Small XRD patterns of silica nanoparticles prepared in the absence of calcium ion

2.4 包裹多肽二氧化硅納米顆粒熒光穩(wěn)定性考察 為了考察二氧化硅納米顆粒是否能有效的保護(hù)多肽的性質(zhì)，將制備好的FITC-GDDHHHHHH＠SNPs（FITC-GDDHHHHHH＠SNPs經(jīng)分子標(biāo)記的FITC-GDDHHHHHH）經(jīng)清洗、離心后，平均分成2部分：一部分在pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中測量熒光值；另一部分在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，在干燥器中放置90 d后，在同樣的緩沖溶液和測量條件下用熒光分光光度計(jì)檢測其熒光值［8-10］。新制備的包裹多肽二氧化硅納米顆粒的熒光光譜圖為實(shí)線；40℃下真空干燥后，在干燥器中保存90 d后的包裹多肽二氧化碳納米顆粒熒光光譜圖為虛線。被二氧化硅納米顆粒包裹的熒光多肽以固體形式保存幾個(gè)月后，再重新分散后，熒光強(qiáng)度為新配置的77.4%（見圖4）。

圖4 納米二氧化硅包裹FITC-GDD6His的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of silica nanoparticles encapsulating FITC-GDD6His

2.5 包裹多肽二氧化硅納米顆粒的載藥率測定 為了準(zhǔn)確測定包裹多肽二氧化硅納米顆粒中多肽的含量，將一份制備好的，并且經(jīng)過清洗干凈的FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs（FITCGDDHHHHHH＠SNPs經(jīng)分子標(biāo)記的FITC-GDDHHHHHH）以及一份沒有載帶任何樣品的二氧化硅納米顆粒分別在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，一同送至上海交大測試中心。用元素分析測得FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs的氮含量為2.87%，而SNPs則沒有得到數(shù)據(jù)，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)啃∮?.1%則無法檢測，從而計(jì)算得到FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs中FITCGDDYHHHHHH的含量為16.39%。

2.6 包裹多肽二氧化硅納米顆粒的包封率 各種不同的多肽在含有0.2 M濃度的鈣離子存在下被二氧化硅納米粒子包埋前后的熒光光譜：實(shí)線為加入的總量，虛線為未包裹的量：A：FITC-GDDD6His；B：FITC-6His；C：FITC-6His-BSA（見圖5）。

圖5 0.2 M濃度的鈣離子存在下各種多肽被二氧化硅納米粒子包埋前后的熒光光譜Fig.5 The fluorescence spectra of various polypeptides before and after being encapsulated by silica nanoparticles in the presence of 0.2 M calcium ion

表1 多肽在不同濃度的鈣離子條件下的包裹率Tab.1 The inclusion rate of polypeptide in the presence of different concentrations of calcium ion

2.7 不同濃度氯化鈣存在下多肽的釋放情況 本實(shí)驗(yàn)中制備包裹多肽的二氧化硅納米顆粒方法比較簡單，只需在傳統(tǒng)的反相微乳液體系中加入適量的鈣離子，就能將帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)或者多肽包裹?。?1-12］。多肽被二氧化硅納米粒子包裹后釋放的情況表明，不同濃度鈣離子存在下被包裹多肽的釋放速率變化不大，只是體外模擬釋放的緩沖液酸堿度影響釋放速率。

圖6 在不同濃度鈣離子存在條件下包裹的FITC-GDD6His＠SNPs在磷酸鹽緩沖液中的釋放情況Fig.6 The release of FITC-GDD6His＠SNPs in phosphate buffer under the condition of different concentrations of calcium ion

3 討論

本文采用經(jīng)典的反相微乳液體系，在反應(yīng)體系中加入微量的鈣離子，通過鈣離子與His或者D的絡(luò)合作用，將多肽固定在合成的二氧化硅納米顆粒中。本試驗(yàn)中同時(shí)研究了鈣離子濃度對反相微乳體系及包裹效率的影響；經(jīng)釋放實(shí)驗(yàn)表明我們合成的材料在體外模擬體液中有穩(wěn)定良好的釋放情況，在酸性條件下釋放很少，在堿性條件下穩(wěn)定高效地釋放。此種方法包裹的多肽二氧化硅納米顆粒有用作口服藥物的潛力?？傊?，通過在傳統(tǒng)的反相微乳液體系中加入適量的鈣離子，可以達(dá)到良好的包裹效果，且其在酸性條件下不易釋放，而在堿性條件則相對容易釋放，符合用于口服藥物載體的基本要求。

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（編校：譚玲，王冬梅）

Study on preparation and properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide

GUO Feng-yi1，SHEN Yu-lian1，WU Sheng-ben1，ZHANG Peng-hui2

（1.Department of Pharmacy，Binzhou People's Hospital，Binzhou 256610，China；2.Department of Clinical Medicine，Medical University of Chongqing，Chongqing 400016，China.）

ObjectiveTo research properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide under different calcium ion concentration conditions and ability changes of encapsulating polypeptide，and determine whether it has properties as an oral carrier.MethodsThe preparation of silica nanoparticles encapsulating polypeptide，release experiment in vivo，characterization of silica nanoparticleswith different polypeptide，and properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide with different concentrations of calcium chloride and different structure were studied.ResultsWith His tagged EGFP（PI 5.99）as amodel，when calcium chloride was added into reversemicroemulsion system，calcium ion could not only form ionic bonds with oxygen atoms inside the silica nanoparticles，but also form complexation with His tags.The protein was immobilized inside the silica nanoparticles，and leaked less after repeated washing.Experimental results of enzyme cutting，heating，urea denaturation showed a good stability.Conclusion By adding proper calcium ion into the traditional reverse microemulsion system，good encapsulating effect could be achieved，and it is not easy to be released in acidic conditions，while in alkaline condition is released relatively easy，which meets the basic requirements for oral drug carrier.

silica nanoparticles；oral drug delivery system；protein and peptide

R383.1

A

1005－1678（2014）08－0092－04

國家自然科學(xué)基金（03031906）

郭豐義，男，大專，主管藥師，研究方向：藥學(xué)，E-mail：15854308649＠163.com。