熒光介孔硅包覆鐵氧化物神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記研究

張波，戚利坤，李立新

（1.青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海西寧810007；2.青海省第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海西寧810007；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

熒光介孔硅包覆鐵氧化物神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記研究

張波1，戚利坤2，李立新3

（1.青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海西寧810007；2.青海省第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海西寧810007；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的以介孔硅包覆磁顆粒M-MS 50與SHU-555A對(duì)比，標(biāo)記永生化神經(jīng)干細(xì)胞C17.2。方法采用了核磁共振，普魯士藍(lán)染色，流式細(xì)胞儀，原子發(fā)射光譜，弛豫儀等一系列檢測(cè)手段，測(cè)定細(xì)胞對(duì)磁顆粒的吞腹量，磁顆粒對(duì)細(xì)胞毒性的影響，及其在細(xì)胞內(nèi)的代謝情況，選擇細(xì)胞標(biāo)記的最優(yōu)條件。結(jié)果在神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)熒光介孔硅包覆鐵氧化物的吞噬行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，隨著孵育時(shí)間增長(zhǎng)，SHU-555A和M-MS 50都更多的被C17.2神經(jīng)干細(xì)胞所吞噬，這表現(xiàn)出細(xì)胞標(biāo)記的時(shí)間依賴性。而M-MS 50在較短時(shí)間內(nèi)便可以對(duì)細(xì)胞有一定的標(biāo)記率。在標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的MRI和ICP-OES定量分析中可以得出，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)SHU-555A和M-MS 50均表現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性，SHU-555A和M-MS 50與C17.2細(xì)胞孵育，都存在標(biāo)記率隨時(shí)間梯度和濃度梯度的增加而提高，直到平衡這一現(xiàn)象。而通過(guò)熒光介孔硅包覆鐵氧化物細(xì)胞內(nèi)分布和代謝研究，發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)記時(shí)間的增長(zhǎng)和標(biāo)記濃度的增加，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率逐漸增加；磁顆粒有沒有從細(xì)胞中代謝出來(lái)，并且在培養(yǎng)多長(zhǎng)時(shí)間之后，細(xì)胞對(duì)M-MS 50的代謝達(dá)到平衡。結(jié)論 介孔硅包覆氧化鐵納米顆粒M-MS 50在標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞C17.2上相對(duì)SHU-555A有較明顯的優(yōu)勢(shì)，而其多功能，特殊的介孔結(jié)構(gòu)，又為以后進(jìn)一步利用提供了更廣闊的空間。M-MS 50能夠有效地縮短周圍質(zhì)子的弛豫時(shí)間，提高弛豫信號(hào)強(qiáng)度，是一種非常優(yōu)越的造影劑。

介孔超順磁性氧化鐵造影劑；核磁共振；神經(jīng)干細(xì)胞

近年來(lái)，隨著分子影像學(xué)和無(wú)創(chuàng)活體顯影檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，尤其是MR技術(shù)的不斷進(jìn)步，采用超順磁性標(biāo)記物作為分子探針，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤，在分辨率、空間示蹤及示蹤時(shí)間和示蹤效果重復(fù)性方面較熒光標(biāo)記法有極其明顯的優(yōu)勢(shì)，具有較高的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景［1-4］。超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米分子探針因良好的生物相容性和MR信號(hào)敏感性［5-7］作為最重要的順磁性標(biāo)記物，廣泛運(yùn)用于干細(xì)胞體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料 C17.2細(xì)胞系，HyClone（美國(guó)）公司。SHU-555A（Bayer Schering Pharma，Berlin，Germany），為經(jīng)過(guò)美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的磁共振造影劑SPIO，表面經(jīng)羧基葡聚糖（carboxydextran）修飾形成，其平均水化粒徑在60 nm左右；熒光介孔硅包覆鐵氧化物（M-MS 50）由上海交通大學(xué)Med-X研究院納米生物醫(yī)學(xué)研究中心所提供。正置熒光顯微鏡DM2500 Leica，德國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將凍存的C17.2神經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇，于37℃水浴搖晃1min左右溶解，吸出細(xì)胞懸液移入裝有5 mL培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中，1200 r／min離心5 min，棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入1 mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和5%馬血清），輕輕吹打均勻，將細(xì)胞懸液移入裝有10mL培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。37℃，5%CO2恒溫培育箱培養(yǎng)。5min左右待細(xì)胞貼壁后，更換新培養(yǎng)基；待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶底85%以上時(shí)，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 普魯士藍(lán)染色處理［8］首先將待標(biāo)記的磁顆粒SHU-555A和M-MS50分別以一定濃度分散在無(wú)血清的DMEM中，將其稀釋為目標(biāo)濃度（Fe濃度分別為5、10、20、33μg／mL）以用于標(biāo)記試驗(yàn)。將貼壁率達(dá)到80%以上的C17.2細(xì)胞的6孔板中培養(yǎng)基吸出，分別加入Fe濃度為10μg／mL的SHU-555A和M-MS 50與無(wú)血清DMEM混合液，放回培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育0.5、1、2、3 h。將貼壁率達(dá)到80%以上的C17.2細(xì)胞的6孔板中培養(yǎng)基吸出，分別加入SHU-555A和M-MS50與無(wú)血清DMEM混合液，F(xiàn)e濃度分別為5、10、20、33μg／mL，放回培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育2 h。將標(biāo)記好的細(xì)胞充分用PBS洗滌之后，4%多聚甲醛固定10 min，于空氣中干燥15 min，確保干燥后的細(xì)胞可用于長(zhǎng)期保存。用PBS再次浸潤(rùn)細(xì)胞5 min，加普魯士藍(lán)染液（與20%鹽酸按1∶1充分混合）染色30 min。用純水洗滌細(xì)胞，吸干表面水分，用10～20μL核固紅染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色10～20min。最后將細(xì)胞用純水，75%、95%無(wú)水乙醇中進(jìn)行清洗，加蓋玻片置于正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率 取1×106個(gè)FITC標(biāo)記的C17.2細(xì)胞于流式管中，加入400μL PBS溶液充分分散，在FACSAriaII流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)介孔磁顆粒M-MS 50在細(xì)胞內(nèi)的位置［9］將C17.2神經(jīng)干細(xì)胞鋪在3.5 cm共聚焦小皿中，待其貼壁并長(zhǎng)至80%之后，以M-MS 50用無(wú)血清DMEM稀釋至Fe濃度為10μg／mL與神經(jīng)干細(xì)胞C17.2共同孵育2 h，用1mL PBS和200μL胰酶共同快速洗滌細(xì)胞吸取洗滌液以除去細(xì)胞外壁粘附和培養(yǎng)液中未被細(xì)胞吞噬的磁顆粒，之后將其加入500μL DAPI染料在37℃下染15min，將樣品用Leica TCS SP5共聚焦掃描激光顯微鏡掃描，30min內(nèi)設(shè)定逐層掃描參數(shù)為50 nm，共掃描80個(gè)焦平面。

1.2.5 細(xì)胞中熒光介孔硅包覆鐵氧化物的保持研究［10］將充分共育2 h的細(xì)胞中培養(yǎng)液吸出，每孔加入1 mL PBS緩沖液充分震蕩洗滌3次，加入1 mL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)1 h，更換加入新鮮無(wú)血清DMEM，收集舊培養(yǎng)基采用mq60弛豫分析儀測(cè)量其信號(hào)強(qiáng)度。分別收集共育結(jié)束后的第3，6，12，24，48，72 h培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 ICP-OES定量測(cè)定細(xì)胞吞噬的鐵含量［11］將待標(biāo)記的磁顆粒SHU-555A和M-MS50分別以一定濃度分散在無(wú)血清的DMEM中，將其稀釋為目標(biāo)Fe濃度（5、10、20、33μg／mL）以用于標(biāo)記試驗(yàn)。在生長(zhǎng)良好的，長(zhǎng)滿80%～90%C17.2神經(jīng)干細(xì)胞3.5 cm培養(yǎng)皿中分別加入SHU-555A和M-MS50與無(wú)血清DMEM混合液，F(xiàn)e濃度分別為5、10、20、33μg／mL，放回培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育2 h。在生長(zhǎng)良好的，長(zhǎng)滿80%～90% C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的3.5 cm培養(yǎng)皿中分別加入Fe濃度為10μg／mL的SHU-555A和M-MS 50與無(wú)血清DMEM混合液，放回培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育0.5、1、2、3 h。將制備的MRI樣品常溫下融化，離心除去上清PBS和明膠混合溶液，加1 mL濃硝酸，于37℃恒溫箱靜置24～48 h，待細(xì)胞完全被消化后，將樣品定容至10m L，采用ICP-OES技術(shù)定量鐵濃度C，測(cè)得數(shù)據(jù)單位mg／L。

1.2.7 MRI成像 本實(shí)驗(yàn)中采用37℃下濃度為2%的明膠溶液來(lái)分散細(xì)胞，制備可供體外磁共振成像的樣品。將一定量（5×105）細(xì)胞收集入2 mL離心管中，離心去除上清液，用300μL明膠溶液充分分散細(xì)胞后置于冰塊中30 min凝固，此過(guò)程應(yīng)非常小心，避免產(chǎn)生氣泡，后用明膠填充離心管內(nèi)的其余空間。將上述方法處理過(guò)得細(xì)胞于冰箱中保存，掃描成像過(guò)程中，成像的細(xì)胞樣品置于盛水的塑料盒中。M-MS 50和SHU555A在不同F(xiàn)e濃度梯度（5、10、20、33μg／mL，2 h）和不同時(shí)間梯度（Fe濃度＝10μg／mL，0.5、1、2、3 h）條件下標(biāo)記細(xì)胞，取制備成在明膠中均勻分散的樣品，在3 T磁共振掃描系統(tǒng)中顯像的成像結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)熒光介孔硅包覆鐵氧化物的吞噬行為

采用普魯士藍(lán)染色來(lái)定性分析SHU555A和M-MS 50 2種納米磁顆粒對(duì)C17.2細(xì)胞的標(biāo)記。圖1是SHU555A和M-MS 50標(biāo)記細(xì)胞的普魯士藍(lán)染色結(jié)果。圖中紅色是核固紅染色的細(xì)胞核，藍(lán)色是普魯士藍(lán)染色的氧化鐵納米顆粒。細(xì)胞吞噬磁顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，留在細(xì)胞核的周圍。A圖所示為SHU-555A和M-MS 50以相同F(xiàn)e濃度梯度孵育細(xì)胞2 h的結(jié)果。從中可以看出，在每一個(gè)濃度梯度，M-MS 50標(biāo)記的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞比SHU-555A所標(biāo)記的結(jié)果呈現(xiàn)出更多的藍(lán)色，因而更多量的磁顆粒被細(xì)胞所吞噬；相同標(biāo)記時(shí)間（2 h）情況下，磁顆粒濃度越高，細(xì)胞吞噬的磁顆粒含量越多，直到達(dá)到飽和。B圖是SHU-555A和M-MS 50以Fe濃度10μg／mL共同時(shí)間梯度孵育細(xì)胞的結(jié)果。從氧化鐵納米顆粒所呈現(xiàn)藍(lán)色的濃度看出，M-MS 50更易被細(xì)胞吞噬。而隨著孵育時(shí)間增長(zhǎng)，SHU-555A和M-MS 50都更多的被C17.2神經(jīng)干細(xì)胞所吞噬，這表現(xiàn)出細(xì)胞標(biāo)記的時(shí)間依賴性。而M-MS 50在較短時(shí)間內(nèi)便可以對(duì)細(xì)胞有一定的標(biāo)記率。

圖1 SHU555A和M-MS 50標(biāo)記細(xì)胞Fe濃度梯度（A）和時(shí)間梯度（B）的普魯士藍(lán)染色結(jié)果Fig.1 SHU555A and M-MS 50 Fe labeled cells in a concentration gradient（A）and time gradient（B）results of Prussian blue staining

2.2 標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的MRI和ICP-OES定量分析

2.2.1 MRI成像結(jié)果 M-MS50和SHU555A在不同F(xiàn)e濃度梯度（5、10、20、33μg／mL，2 h）和不同時(shí)間梯度（Fe濃度＝10 μg／mL，0.5、1、2、3 h）條件下標(biāo)記細(xì)胞的MRIT2成像結(jié)果見圖2。M-MS 50應(yīng)用于細(xì)胞磁共振顯像，能夠顯著改進(jìn)細(xì)胞磁共振顯像的靈敏度。在低濃度及相同濃度標(biāo)記時(shí)間較短的時(shí)候，MMS 50能夠顯著縮短周圍質(zhì)子的弛豫時(shí)間，呈現(xiàn)低信號(hào)，證明M-MS 50能夠在較短的時(shí)間內(nèi)取得很明顯的細(xì)胞標(biāo)記率，且在起初較短時(shí)間內(nèi)，標(biāo)記率的差異性不大。而濃度較高的情況下，細(xì)胞標(biāo)記效率非常明顯，信號(hào)很高。整體來(lái)說(shuō)，SHU-555A和MMS50與C17.2細(xì)胞孵育，都存在標(biāo)記率隨時(shí)間梯度和濃度梯度的增加而提高，直到細(xì)胞標(biāo)記飽和，這與之前普魯士藍(lán)染色結(jié)果一致。證明C17.2神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)SHU-555A和M-MS 50均表現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

圖2 M-MS 50和SHU555A在不同F(xiàn)e濃度梯度和不同時(shí)間梯度條件下標(biāo)記細(xì)胞的MRIT2成像結(jié)果Fig.2 MRIT2 imaging results of the M-MS 50 and SHU555A in different Fe concentration gradient and different time gradient conditions labeled cells

2.2.2 ICP-OES對(duì)MRI樣品內(nèi)鐵含量定量分析 圖3為ICP-OES檢測(cè)的Fe濃度結(jié)果，其單位為pg／cell。從中可以看出，隨孵育時(shí)間增加，M-MS 50被C17.2神經(jīng)干細(xì)胞吞噬的量明顯高于SHU-555A被吞噬的量，但濃度梯度之間，與SHU-555A的吞噬量差異不大。較短的孵育時(shí)間內(nèi)，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)M-MS 50的吞噬量遠(yuǎn)高于SHU-555 A，達(dá)到13.58 pg／cell，而SHU-555A的細(xì)胞吞噬量?jī)H為6.1 pg／cell。這證明M-MS 50在較短時(shí)間內(nèi)就為細(xì)胞所吞噬，可以達(dá)到快速標(biāo)記的目的。而隨著濃度的增加，相同孵育時(shí)間下，M-MS 50為C17.2吞噬量均高于SHU-555A，而當(dāng)Fe濃度達(dá)到33μg／mL時(shí)，M-MS 50的吞噬量顯著高于SHU-555A，達(dá)到29 pg／cell，而SHU-555A僅為14 pg／cell。但整體來(lái)說(shuō)，SHU-555A和M-MS 50與C17.2細(xì)胞孵育，都存在標(biāo)記率隨時(shí)間梯度和濃度梯度的增加而提高，直到平衡這一現(xiàn)象。

圖3 MRI樣品時(shí)間梯度（A）和濃度梯度（B）的ICP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The MRIsample time gradient（A）and the concentration gradient（B）ICP detection results

2.3 熒光介孔硅包覆鐵氧化物細(xì)胞內(nèi)分布和代謝研究

2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率 圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率。主要通過(guò)M-MS 50中所含的FITC平均熒光強(qiáng)度，來(lái)測(cè)定細(xì)胞中磁顆粒的標(biāo)記率。從圖中可以看出，隨著標(biāo)記時(shí)間的增長(zhǎng)和標(biāo)記濃度的增加，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率逐漸增加。但在時(shí)間較短和濃度較低的時(shí)候，其標(biāo)記率較低，并且區(qū)別不大。與之前普魯士藍(lán)染色結(jié)果相比，然而流式細(xì)胞儀通過(guò)對(duì)FITC熒光強(qiáng)度的檢測(cè)并未顯示出較高的細(xì)胞標(biāo)記率，僅為30%左右，可能是由于大量的M-MS 50在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部團(tuán)聚，造成細(xì)胞局部磁顆粒濃度較高，F(xiàn)ITC濃度較高，進(jìn)而導(dǎo)致熒光猝滅不利于檢測(cè)［2-4］。證明隨著標(biāo)記時(shí)間的增長(zhǎng)和標(biāo)記濃度的增加，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率逐漸增加。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率Fig.5 cellmarkers for the detection of flow cytometer rate

2.3.2 共聚焦激光掃描顯微鏡測(cè)M-MS 50在細(xì)胞內(nèi)的分布 圖6為M-MS 50以10μg／mL與C17.2神經(jīng)干細(xì)胞共同孵育2 h后的共聚焦照片。其中綠色熒光為M-MS 50中的FITC，藍(lán)色熒光為DAPI染的細(xì)胞核。結(jié)合明場(chǎng)照片，可以清晰看出細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化，磁顆粒主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，并不能進(jìn)入細(xì)胞核。通過(guò)三維剖面圖可以清楚地定位磁顆粒是在細(xì)胞的胞質(zhì)中的。

圖6 M-MS 50（10μg／mL）與C17.2神經(jīng)干細(xì)胞孵育2 h后的共聚焦照片A：C17.2神經(jīng)干細(xì)胞明場(chǎng)照片；B為細(xì)胞的DAPI染色結(jié)果；C為M-MS 50的FITC熒光照片；D為B，C的疊合圖；E為A，B，C的疊合；F為細(xì)胞層掃過(guò)程中所獲得的三維立體剖面圖Fig.6 M-MS 50（10 mu g／m L）and C17.2 neural stem cells were incubated for 2 h by confocal picturesA：Bright field photographs of C17.2 neural stem cells.B：Results the cells DAPI staining.C：FITC fluorescent pictures of M-MS 50.D：B，C compositemap. E：A，B，C compositemap.F：Three dimensional profile obtained in the process of cell layer scan

2.3.3 弛豫儀測(cè)M-MS 50在細(xì)胞中的保持 通過(guò)弛豫儀檢測(cè)M-MS 50被C17.2細(xì)胞吞噬后細(xì)胞內(nèi)的保持情況。通過(guò)弛豫信號(hào)是否增加，可以推斷出磁顆粒有沒有從細(xì)胞中代謝出來(lái)，并且在培養(yǎng)多長(zhǎng)時(shí)間之后，細(xì)胞對(duì)M-MS 50的代謝達(dá)到平衡［12-14］。圖7為M-MS 50被C17.2細(xì)胞吞噬后換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基中弛豫信號(hào)的改變情況。由圖中可以看出，細(xì)胞與磁顆粒結(jié)束共同孵育試驗(yàn)之后，由于換了新鮮的無(wú)血清DMEM，可能存在培養(yǎng)液與細(xì)胞內(nèi)磁顆粒的濃度差異，從而促進(jìn)胞吐作用。在結(jié)束孵育試驗(yàn)的前8 h內(nèi)，細(xì)胞胞吐作用比較旺盛，而8 h之后，基本上磁顆粒不再被細(xì)胞從體內(nèi)代謝出來(lái)。

圖7 M-MS 50被C17.2細(xì)胞吞噬后換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基中弛豫信號(hào)的改變情況Fig.7 M-MS 50 C17.2 cells after phagocytosis was replaced with fresh medium without changing the relaxation signal serum culture

3 討論

本文主要以介孔硅包覆磁顆粒M-MS50與SHU-555A對(duì)比，標(biāo)記永生化神經(jīng)干細(xì)胞C17.2。由于2種磁顆粒粒徑相似，體外的普魯士藍(lán)染色試驗(yàn)定性的證明M-MS 50對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞C17.2在濃度梯度上（≤33μg／mL）標(biāo)記效率比SHU-555A高得多，而時(shí)間梯度，在短時(shí)間（5 h以內(nèi)），標(biāo)記效率略高于SHU-555A，而長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記之后，其可能通過(guò)較為強(qiáng)烈的胞吐作用被代謝出來(lái)，因而標(biāo)記效率不如SHU-555A。普魯士藍(lán)染色結(jié)果證明C17.2神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)磁顆粒的吞噬都表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

體外MRI實(shí)驗(yàn)證明，M-MS 50應(yīng)用于細(xì)胞磁共振顯像，能夠顯著改進(jìn)細(xì)胞磁共振顯像的靈敏度。在低濃度及相同濃度標(biāo)記時(shí)間較短的時(shí)候，M-MS 50能夠顯著縮短周圍質(zhì)子的弛豫時(shí)間，呈現(xiàn)低信號(hào)，而標(biāo)記時(shí)間較長(zhǎng)之后，相較于SHU-555A，M-MS 50并不能發(fā)揮其弛豫時(shí)間短，信號(hào)強(qiáng)度高的優(yōu)勢(shì)。但整體來(lái)說(shuō)，SHU-555A和M-MS 50與C17.2細(xì)胞孵育，都存在標(biāo)記率隨時(shí)間梯度和濃度梯度的增加而提高，直到平衡這一現(xiàn)象。對(duì)應(yīng)的ICP定量分析，印證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且當(dāng)高濃度Fe（33μg／mL）孵育C17.2時(shí)，M-MS 50的吞噬量顯著高于SHU-555A。這與之前普魯士藍(lán)染色結(jié)果一致。對(duì)M-MS 50在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)部標(biāo)記率，分布和代謝，分別用流式細(xì)胞儀，共聚焦激光掃描顯微鏡和弛豫儀完成［15］。流式細(xì)胞儀結(jié)果證明M-MS 50對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率還有非常大的提高空間。共聚焦激光掃描顯微鏡的圖像能夠確定M-MS 50進(jìn)入C17.2神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)部，主要分布在胞質(zhì)中。弛豫儀結(jié)果說(shuō)明M-MS 50在標(biāo)記C17.2神經(jīng)干細(xì)胞之后8 h內(nèi)面臨較為旺盛的細(xì)胞胞吐過(guò)程，如何提高M(jìn)-MS 50在細(xì)胞內(nèi)不被代謝出來(lái)，還需要進(jìn)一步的研究。

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（編校：吳茜）

Research on fluorescentmesoporous silica-coated iron oxide labeled neural stem cell

ZHANG Bo1，QILi-kun2，LILi-xin3

（1.Department of Neurology，People's Hospital of Qinghai Province，Xining 810007，China；2.Department of Neurology，F(xiàn)ifth People's Hospital of Qinghai Province，Xining 810007，China；3.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo compare M-MS 50 with SHU-555A ofmesoporous silica-coated magnetic particles，label the immortalized neural stem cells C17.2.MethodsSwallowing abdominal volume of cells，the effectofmagnetic particles on cell toxicity and itsmetabolism in cellswere determined by a series of tests such as nuclearmagnetic resonance，Prussian blue staining，flow cytometry，atomic emission spectrometry，relaxation instrument.The optimal conditionswas screened according to the above-mentioned experimental result.ResultsThe resultsof phagocytic behavior ofneural stem cells on the fluorescentmesoporous silica-coated iron oxide showed thatmore and more SHU-555A and M-MS 50 were phagocytosed by neural stem cells C17.2 with the incubation time increased，which illuminated the time dependence of cell labeling.While M-MS 50 could have a certain rate of cells labeling in a relatively short period of time.In MRIand ICP-OES，Phagocytization of neural stem cells C17.2 on SHU-555A and M-MS50 showed a concentration and time dependent manner，SHU-555A and M-MS 50 incubated with C17.2 cells showed labeled rates increased with the increase of time and concentration gradients，until the balance.Intracellular distribution and metabolism research of，fluorescentmesoporous silica-coated iron oxide showed that neural stem cell C17.2 labeling rate increased with the increase of time and concentration gradients，gradually.Conclusion Mesoporous silicacoated iron oxide nanoparticles of M-MS 50 has obvious advantages over SHU-555A in labeling neural stem cells C17.2，but itsmultifunctional，special mesoporous structure provideswider space for further use.M-MS 50 could effectively shorten the relaxation time of surrounding proton，improve the relaxation signal strength，which is a very excellent contrast agent.

mesoporous silica-coated SPIO contrast agent；MRI；neural stem cell

張波，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科常見病、多發(fā)病及神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)，E-mail：qch1821460057＠163.com。

R730.5

A

1005－1678（2014）08－0060－05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171147）