SDF-1在牽張成骨中的表達(dá)及作用機(jī)制研究

周恩瑜，李天泉，李保康，鄔玉林，劉亮，屈依麗

（1.四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院外四科，四川甘孜626000；2.四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院手術(shù)室，四川甘孜626000；3.四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，四川成都610207）

SDF-1在牽張成骨中的表達(dá)及作用機(jī)制研究

周恩瑜1，李天泉1，李?？?，鄔玉林1，劉亮1，屈依麗3

（1.四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院外四科，四川甘孜626000；2.四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院手術(shù)室，四川甘孜626000；3.四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，四川成都610207）

目的探討基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在大鼠下頜骨中牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）區(qū)的表達(dá)情況及其作用機(jī)制。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為8組，每組各5只，全部將右側(cè)下頜骨表面皮膚切開，放置下頜骨牽張器，調(diào)整塑形并固定。而后將大鼠左側(cè)下頜骨骨折行鈦板內(nèi)固定手術(shù)以作對(duì)照。隨后分別于不同的時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9、12、15、18、21 d）將大鼠麻醉處死，解剖大鼠雙側(cè)下頜骨后，小心刮取右側(cè)牽張間隙骨痂及左側(cè)骨折處骨痂進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。結(jié)果40只大鼠傷口均愈合正常，手術(shù)耐受性良好。免疫組化染色結(jié)果顯示：SDF-1在成骨細(xì)胞和微血管周圍表達(dá)較多，且在DO的新生骨痂中的表達(dá)較骨折處骨痂中的表達(dá)明顯升高。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)結(jié)果顯示：無論在DO區(qū)或是骨折區(qū)，SDF-1術(shù)后3 d的表達(dá)量增加了3倍，術(shù)后1周后，SDF-1在骨折區(qū)的表達(dá)情況呈逐漸下降趨勢(shì)，在DO區(qū)的表達(dá)在進(jìn)入牽張期內(nèi)其再次上升，高達(dá)原有水平的5倍，牽張結(jié)束后緩緩下降，SDF-1在2區(qū)的表達(dá)情況比較分別在9、12、15 d天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論SDF-1在牽張成骨區(qū)和骨折區(qū)的表達(dá)差異明顯，為日后研究SDF-1在牽張成骨中的表達(dá)及作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

牽張成骨；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1；酶聯(lián)免疫吸附法

牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）是指在截開的骨縫處安置可以施加牽引力的牽張裝置來牽張骨段，從而促進(jìn)骨縫間新生骨組織的形成［1］。近些年隨著牽張成骨技術(shù)的不斷完善，此技術(shù)得到了越來越廣泛的應(yīng)用?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞及相關(guān)上皮細(xì)胞分泌的一種趨化蛋白，屬于趨化因子家族，在免疫調(diào)節(jié)［2-4］、炎癥反應(yīng)［5-6］、免疫性疾?。?］、HIV感染［8］、腫瘤細(xì)胞的遷移［9-10］等方面均起到了重要作用。國內(nèi)外當(dāng)前對(duì)SDF-1在牽張成骨中的表達(dá)情況研究較少，故本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究SDF-1在牽張成骨新生骨痂中的表達(dá)情況，并以一般的骨折愈合為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比性研究，希望對(duì)其在DO中的作用機(jī)制做出初步分析。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 外置式大鼠單側(cè)下頜骨牽張器、勻4孔微型鈦板（西安中邦鈦生物材料公司），臺(tái)式離心機(jī)-ST16R（德國賽默飛世爾公司），低速離心機(jī)LXJ-64-01型（長沙湘儀離心機(jī)有限公司），其他手術(shù)工具均購自上海康為醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。主要試劑有1%戊巴比妥鈉溶液，生理鹽水，2%利多卡因注射液，紅霉素軟膏，注射用青霉素，碘伏溶液。

1.2 單側(cè)下頜骨牽張成骨大鼠模型的構(gòu)建 雄性Sprague-Dawle大鼠40只，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020，體質(zhì)量300～350 g，購自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，給予正常飼養(yǎng)。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理，并注射適當(dāng)劑量的青霉素。將大鼠麻醉后固定于動(dòng)物臺(tái)上，取仰臥位，刮毛，備皮，碘伏消毒。將右側(cè)下頜骨表面皮膚切開，沿骨膜下進(jìn)行分離，暴露下頜角和下頜骨體，放置下頜骨牽張器，調(diào)整塑形使之與下頜骨頰側(cè)完全貼合后，微型螺釘固定。牽張器固定完成后使用慶大霉素反復(fù)沖洗創(chuàng)面，逐層縫合并涂抹紅霉素軟膏。將大鼠左側(cè)下頜骨骨折行鈦板內(nèi)固定手術(shù)以作對(duì)照。待大鼠完全蘇醒后，當(dāng)日禁食，日后給予軟飼料飼養(yǎng)并檢測(cè)切口，定期消毒。

1.3 大鼠模型分組 將40只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，每組5只，根據(jù)術(shù)后大鼠蘇醒后處死時(shí)間的不同，命名為A組（術(shù)后當(dāng)天取材）、B組（延遲期內(nèi)，術(shù)后3 d）；C組（牽張加力1 d，術(shù)后6 d）、D組（牽張加力4 d后，術(shù)后9 d）、E組（牽張加力7 d、術(shù)后12 d）、F組（牽張加力10 d后，術(shù)后15 d）、G組（固定期3 d后，術(shù)后18 d）、H組（術(shù)固定期6 d后，術(shù)后21 d）。取手術(shù)區(qū)下頜骨松質(zhì)骨進(jìn)行檢測(cè)；取材時(shí)沿著骨斷端界面處完整地截取右側(cè)牽張間隙骨痂及左側(cè)骨折處骨痂進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 SDF-1的表達(dá)與檢測(cè) 將所得標(biāo)本進(jìn)行甲醛溶液固定24 h后，10%的EDTA脫鈣7 d后進(jìn)行脫水、石蠟包埋，沿牽張方向切得4μm水平切片，將組織切片于室溫下與含0.1%胰蛋白酶的PBS共同培養(yǎng)30min；滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠SDF-1多克隆抗體50μL，孵育2 h，以含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育30min，以含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加HRP辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育30min，以含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次進(jìn)行DAB染色，復(fù)染，封片進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

所有標(biāo)本于4℃下研磨裂解，離心15 min后取上清液進(jìn)行總蛋白測(cè)定。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定SDF-1的含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并將酶聯(lián)免疫吸附結(jié)果以時(shí)間為橫軸，SDF-1的表達(dá)相對(duì)增高的倍數(shù)為縱軸，繪制動(dòng)態(tài)曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 SDF-1在牽張成骨及骨折區(qū)內(nèi)的表達(dá)情況 40只實(shí)驗(yàn)大鼠傷口愈合正常，手術(shù)耐受性良好，在取材日期內(nèi)均保持正常健康的狀態(tài)。

免疫組化染色結(jié)果顯示：SDF-1在成骨細(xì)胞和微血管周圍表達(dá)較多，且在DO的新生骨痂中的表達(dá)較骨折處骨痂中的表達(dá)明顯增多（見圖1）。

圖1 SDF-1在牽張成骨區(qū)與骨折區(qū)的表達(dá)Fig.1 Expression of SDF-1 in distraction osteogenesis and fracture zone

2.2 SDF-1表達(dá)隨時(shí)間變化趨勢(shì) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：無論在DO區(qū)或是骨折區(qū)，SDF-1術(shù)后3 d的表達(dá)量增加了3倍，術(shù)后1周，SDF-1在骨折區(qū)的表達(dá)情況呈逐漸下降趨勢(shì)，在DO區(qū)的表達(dá)在進(jìn)入牽張期內(nèi)再次上升，至原有水平的5倍，牽張結(jié)束后緩緩下降，SDF-1在2個(gè)區(qū)的表達(dá)情況比較分別在9、12、15 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1、圖2）。

表1 SDF-1在DO區(qū)與骨折區(qū)的表達(dá)比較（μg／L）Tab.1 Expression of SDF-1 in DO and the fracture zone（μg／L）

圖2 SDF-1在牽張成骨區(qū)與骨折區(qū)的表達(dá)趨勢(shì)*P＜0.05，與DO區(qū)比較Fig.2 Expression trend of SDF-1 in distraction osteogenesis and fracture zone *P＜0.05，compared with DO zone

3 討論

隨著科技的不斷進(jìn)步，牽張成骨技術(shù)的研究也在不斷地深化，但考慮到目前牽張成骨技術(shù)的復(fù)雜性與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的手術(shù)耐受性，一般多采用兔、犬等大型動(dòng)物，但是這些動(dòng)物的飼養(yǎng)周期長、動(dòng)物成本高、實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，以上一系列因素嚴(yán)重影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的普遍性和廣泛性，對(duì)研究結(jié)果的影響程度較大，故本實(shí)驗(yàn)考慮采用SD大鼠作為動(dòng)物模型。SD大鼠的成本較之兔、犬等低廉，可以在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的研究取材，且SD大鼠為常見的動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)員對(duì)其的手術(shù)操作較為熟練，可在一定程度上降低不必要的損傷與人為誤差，從而提高實(shí)驗(yàn)的成功率與準(zhǔn)確性［11］。加之考慮到SD大鼠骨代謝的規(guī)律同人體基本相似，故確定SD大鼠為本次實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物模型。

在牽張成骨的手術(shù)中，對(duì)大鼠下頜骨的骨切開線的設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的，也是影響著手術(shù)成敗的關(guān)鍵。有研究報(bào)道，將下頜骨骨切開線的位置設(shè)定在第2磨牙到第3磨牙之間，從生理學(xué)講，此位置處于下頜體部位，骨切開線兩側(cè)的骨質(zhì)偏厚，對(duì)牽張器的固定是極為有利的，但此位置也極易與口腔穿通，從而造成傷口感染，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性致使實(shí)驗(yàn)失?。?2］。也有研究報(bào)道，將骨切開線的位置選定在下頜骨的升支乙狀切跡處，該位置距離口腔較遠(yuǎn)，可在一定程度上避免口腔穿通，從而降低術(shù)后感染情況，但實(shí)際上下頜骨的升支骨的骨質(zhì)較薄，無法承受牽張器工作過程中的牽張力，從而造成手術(shù)過程中的骨折，術(shù)后不易固定以及牽張器在工作中脫落等情況，使得在下頜骨的升支乙狀切跡處設(shè)置骨切開線也難以實(shí)現(xiàn)［13］。本實(shí)驗(yàn)在綜合分析了前人的研究和嘗試后，最后確定將本次實(shí)驗(yàn)的骨切開線設(shè)定在磨牙后方、下頜升支前緣，經(jīng)分析可知，該處的骨質(zhì)具有一定的斜向坡度且具有一定的厚度可以承受手術(shù)過程中的壓力和牽張力，并為后面螺釘?shù)墓潭ㄌ峁┝俗銐虻闹瘟?，該位置也離口腔較遠(yuǎn)，不易感染與穿通，從而極大降低了術(shù)后的感染風(fēng)險(xiǎn)，為術(shù)后康復(fù)提供了保障。

SDF-1由多種細(xì)胞分泌，且表達(dá)于人體的多種組織，如心臟、腎臟、大腦、胎盤、卵巢等［14-17］。CXC族細(xì)胞因子受體 4（CXCR4）是SDF-1的唯一天然受體，且SDF-1與CXCR4之間的信號(hào)通路在維持機(jī)體的多項(xiàng)生理功能中具有重要的作用，如介導(dǎo)免疫反應(yīng)，參與胚胎發(fā)育和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，調(diào)控干細(xì)胞遷移等。迄今為止，在牽張成骨的研究中，SDF-1的表達(dá)及其作用并未被深入研究。

國內(nèi)外研究表明，在牽張成骨的實(shí)驗(yàn)中，牽張期內(nèi)大鼠體內(nèi)會(huì)分泌各種生長因子，IL-1、IL-6和TNF-α等因子均會(huì)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，這與骨折愈合過程較為相似［18］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牽張成骨的細(xì)胞機(jī)理及分析作用機(jī)理均較為獨(dú)特。例如DO的骨再生方式主要以膜內(nèi)成骨為主，而在骨折愈合中主要以軟骨成骨為主；在DO間隙內(nèi)存在大量未礦化的骨質(zhì)而骨折區(qū)內(nèi)的軟骨已礦化成骨；在血管生成時(shí)間中也略有不同，DO區(qū)一般在牽張開始后就開啟血管生成模式而骨折區(qū)一般在骨折后的1～2周內(nèi)，此外，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的高水平表達(dá)也與牽張成骨密切相關(guān)［19］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SDF-1在DO中的表達(dá)情況分析，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步分析；DO的分子生物學(xué)機(jī)理較為復(fù)雜，相信隨著對(duì)骨形成、修復(fù)的不斷研究，對(duì)其的了解會(huì)越來越深入。

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（編校：吳茜）

Study on SDF-1 expression in distraction osteogenesis and its reaction mechanism

ZHOU En-yu1，LITian-quan1，LIBao-kang2，WU Yu-lin1，LIU Liang1，QU Yi-li3

（1.Forth Department of Surgery，People's Hospital of Sichuan Province Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture，Ganzi626000，China；2.Operation Room，People's Hospital of Sichuan Province Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture，Ganzi626000，China；3.Department of Clinical Medicine，Sichuan University，Chengdu 610207，China）

ObjectiveTo explore the expression of stromal cell-derived factor-1 in ratmandibular bone area in distraction osteogenesis and its mechanism of action.Methods40 SD ratswere randomly divided into eight groups，each had five rats，all the surface of skin incision on the rightside ofmandible，mandibular distractor placement，adjust shaping and fixed.The lower left side of the ratmandibular fractures after internal fixation with a titanium plate as controls.Subsequently，ratswere sacrificed at different time points（0，3，6，9，12，15，18，21 d），dissected rat bilateralmandible，carefully scraping the callus from the right side of the distraction gap and left side of the fracture zone for chemical tests and enzyme-linked immunosorbent assay immunohistochemistry.Results40 rats were all in normal wound healing with good operation tolerance；Immunohistochemical staining showed that，the expression of SDF-1 in osteogenic cells and capillaries around were increased，and its expression in DO freshmen zonewasmore than fracture zone；ELISA test results showed：the expression of SDF-1 at3 days after operation were increased triple both in DO zone and fracture zone. And one week after surgery，SDF-1 expression in the fracture zone was decreased，and in DO zone rising again before entering the distraction period，up to five times，the differences of SDF-1 expression between two zone at9，12，15 d were all significant（P＜0.05）.Conclusion SDF-1 expression levels were different in distraction bone area and fracture zones，which can lay the foundation for future research of SDF-1 expression in distraction and its mechanism.

distraction osteogenesis；stromal cell-derived factor-1；enzyme-linked immunosorbent assay

R681

A

1005－1678（2014）08－0023－03

博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20090181120049）

周恩瑜，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷骨科，E-mail：zey13618139364＠163.com。