NF-κB抑制劑PDTC對人白血病Jurkat細胞凋亡及MMP-9表達的影響

付利，李業(yè)成，蘇毅，孫浩平，帥燕容，夏焱

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院血液內科，四川成都610083；2.中山大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510120）

NF-κB抑制劑PDTC對人白血病Jurkat細胞凋亡及MMP-9表達的影響

付利1，李業(yè)成1，蘇毅1，孫浩平1，帥燕容1，夏焱2

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院血液內科，四川成都610083；2.中山大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510120）

目的研究NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）對Jurkat細胞凋亡及基質金屬蛋白酶-9（matrxmetallo preteinases-9，MMP-9）基因表達的影響，探討轉錄因子NF-κB與MMP-9在白血病發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移過程中的作用及2者之間的關系。方法取處于對數(shù)生長期的Jurkat細胞隨機分為6組，包括對照組（培養(yǎng)基中不含PDTC），試驗組（培養(yǎng)基中分別含有50、100、150μmol／LPDTC、1μg／mL VCR、1μg／mL VCR＋150μmol／L PDTC）；MTT法測定PDTC對Jurkat細胞增殖的抑制作用；使用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測PDTC聯(lián)合長春新堿（vincristine oncovin，VCR）誘導Jurkat細胞凋亡的情況；使用半定量RT-PCR檢測Jurkat細胞中MMP-9基因的表達。結果不同濃度的PDTC（50、100、150μmol／L）作用不同時間（12～48 h）后對Jurkat細胞的增殖抑制率隨PDTC濃度的增高及作用時間的延長而逐漸增加（P＜0.05），但在PDTC處理48 h后，細胞增殖抑制率無明顯增加。在不同濃度的PDTC分別處理細胞48 h后，隨著PDTC濃度增高，Jurkat細胞凋亡率逐漸增加，各實驗組凋亡率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與單純VCR組相比，VCR＋PDTC組Jurkat細胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），顯示PDTC可以增強VCR誘導的Jurkat細胞凋亡作用。不同濃度的PDTC分別處理各組細胞48 h，RT-PCR結果顯示各實驗組細胞MMP-9基因表達水平與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論白血病細胞中存在MMP-9基因高表達，導致細胞基底膜及細胞外基質降解，促進了白血病的浸潤和轉移，并引起化療耐藥，而這一過程可被NF-κB抑制劑PDTC所抑制，為臨床上白血病的治療探索了一條新的途徑。

NF-κB；PDTC；基質金屬蛋白酶-9；Jurkat細胞

目前對于白血病患者最常用的治療方法是化療，大多數(shù)患者通過化療可得到緩解，但近年來由于耐藥問題的存在，部分患者因為化療失敗而導致死亡［1-3］。在兒童白血病中，最常見的為急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL），近年來廣泛開展的造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）以及不斷改進的化療方案，明顯提高了兒童ALL的治愈率，德國研究組統(tǒng)計其總的長期治愈率超過75%［4-8］。但仍存在部分患兒對化療不敏感，有研究顯示，這類患兒化療失敗的主要原因是對治療藥物產生了耐藥［9］。如何使這類難治性白血病達到臨床完全緩解（complete remission，CR）和長期無病生存（disease free survival，DFS），成為目前兒童白血病研究的重點和難點［10］。

本研究旨在通過體外實驗的方法，采用NF-κB特異性抑制劑PDTC作用于Jurkat細胞，檢測其對細胞凋亡及MMP-9基因表達的影響，探討轉錄因子NF-κB與MMP-9在白血病發(fā)生發(fā)展及浸潤轉移過程中的作用及2者之間的關系；另外，通過觀察PDTC聯(lián)合化療藥物VCR對Jurkat細胞凋亡的影響，探討PDTC在白血病治療中的潛在價值，為臨床應用PDTC治療兒童難治性ALL提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：人急性T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat細胞，由中山醫(yī)學院細胞中心提供。

主要試劑：長春新堿（VCR）、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、PDTC，美國Sigma公司；RPMI1640，美國Gibco公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物材料公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），美國Promega公司；RT-PCR試劑盒，天為時代；Annexin V-FITC試劑盒，武漢晶美生物公司；DNA Marker TaKaRa，生物技術有限公司；Trizol，Invitrogen公司；碘化丙錠，美國庫爾特公司；雙抗（青霉素、鏈霉素），華北制藥廠；異丙醇、氯仿，武漢聯(lián)堿廠；瓊脂糖，亞法生物試劑公司；無水乙醇，上海振興化工廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Jurkat細胞生長在含5mLRPMI1640培養(yǎng)基（內含10%FBS及雙抗）的無菌細胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2，相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，24 h后更換一次培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d進行1次細胞傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞作為實驗對象。

1.2.2 實驗分組 取處于對數(shù)生長期的Jurkat細胞隨機分為以下6組：對照組培養(yǎng)基中既不含PDTC，又不含VCR；試驗組1：培養(yǎng)基中不含VCR，PDTC濃度為50μmol／L；試驗組2：培養(yǎng)基中不含VCR，PDTC濃度為100μmol／L；試驗組3：培養(yǎng)基中不含VCR，PDTC濃度為150μmol／L；試驗組4：培養(yǎng)基中不含PDTC，VCR濃度為1μg／mL；試驗組5：培養(yǎng)基中PDTC濃度為150μmol／L，VCR濃度為1μg／mL。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍（MTT）法測定PDTC對Jurkat細胞增殖的抑制作用 取處于對數(shù)生長期的Jurkat細胞，更換新鮮培養(yǎng)液，調整細胞濃度為1×105個／mL，接種于48孔培養(yǎng)板，每孔加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液及PDTC，使PDTC的終濃度分別為0、50、100、150μmol／L，每一個PDTC濃度設4個重復孔，將加好藥的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2、飽和相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為12、24、36、48 h，在距離培養(yǎng)結束4 h時，于每孔中均加入濃度為5 mg／m L的MTT液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心培養(yǎng)板（1000 r／min，4min），棄上清液，每孔加入150μL DMSO，置于微孔板振蕩器上振蕩10min，完全溶解結晶物，于波長570nm處使用自動酶標儀測定各孔OD值，實驗共重復4次，實驗結果取每次獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值。其中細胞生長抑制率計算公式為：細胞增殖抑制率＝（1-實驗孔OD值／對照孔OD值）×100%。

1.2.4 流式細胞術（FCM）檢測PDTC聯(lián)合長春新堿（VCR）誘導Jurkat細胞凋亡的情況 將細胞濃度為1×106個／mL的Jurkat細胞接種于6孔板的6個孔中，依次加入藥物及培養(yǎng)基，使得每孔中最終的藥物濃度如1.2.2分組所示數(shù)值，常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，分別加入1 mL PBS液，輕輕震蕩使細胞懸浮，4℃離心（1000 r／min，5min），小心棄去上清液。重復操作2次后，加入190μL結合緩沖液并輕輕震蕩使細胞重新懸浮，滴入10μL Annexinv-FITC，混勻，4℃避光靜置30min，離心（1000 r／min，5min），棄上清液，再次加入190μL結合緩沖液使細胞重懸，滴入10μL PI，輕輕震蕩混勻，上流式細胞儀進行檢測。重復試驗3次。記錄實驗數(shù)據(jù)并進行凋亡率分析。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測Jurkat細胞中MMP-9基因的表達 取每組標本的PCR擴增產物各5μL，分別與5μL的β-actin PCR擴增產物及2μL的Loading Buffer經吹打混合均勻后，依次加入瓊脂糖凝膠板的上樣孔中并做好標記，另選一孔加入5μL DNA Marker作為標準分子量對照。連接電源進行電泳，設置電壓100V，時間50min。應用凝膠圖像分析系統(tǒng)對各電泳條帶進行分析，結果以各組目的基因PCR產物光密度與β-actin PCR產物光密度的比值表示。每組標本重復進行4次實驗取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理；實驗結果的數(shù)據(jù)以“±s”表示，2組間均值的比較采用t檢驗；多組間均值的比較首先使用單因素方差分析，兩兩組間的均值比較使用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDTC對Jurkat細胞增殖的影響 PDTC對Jurkat細胞的增殖抑制率在各組之間有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。PDTC在體外對Jurkat細胞增殖的抑制率，隨藥物濃度的增加及作用時間的延長，呈增加趨勢，顯示在一定濃度和時間范圍內，PDTC對Jurkat細胞增殖的抑制作用呈時間-劑量依賴性（見表1）。

表1 PDTC對人白血病Jurkat細胞增殖的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of PDTC on Jurkat cell proliferation

2.2 PDTC對Jurkat細胞凋亡的影響 按分組進行加藥，不同濃度的PDTC分別處理各組細胞48 h后，流式細胞術（FCM）檢測各組細胞凋亡情況。結果顯示，細胞凋亡率隨PDTC濃度的增高而增加，濃度分別為50、100、150μmol／L的PDTC作用于Jurkat細胞48 h后，其凋亡率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且不同濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VCR組和VCR＋PDTC組Jurkat細胞凋亡率相比，VCR＋PDTC組Jurkat細胞凋亡率顯著高于VCR組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見表2）。

表2 經培養(yǎng)48 h后各實驗組Jurkat細胞凋亡率Tab.2 Jurkat cell apoptosis rate in different experimental groups after being cultured for 48 h

2.3 PDTC對Jurkat細胞MMP-9表達的影響 半定量RTPCR結果表明：濃度分別為50、100、150μmol／L的PDTC作用于Jurkat細胞48 h后，各試驗組組細胞MMP-9基因表達水平與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），且隨PDTC濃度的增高，MMP-9基因表達水平逐漸降低，不同PDTC濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明Jurkat細胞中MMP-9基因表達水平與PDTC濃度成負相關（見圖1），而PDTC下調Jurkat細胞中MMP-9基因表達水平可能是通過抑制NF-κB活性實現(xiàn)的。

圖1 PDTC對Jurkat細胞MMP-9 mRNA表達的影響*P＜0.05，與對照組（0μmol／L）比較Fig.1 Effect of PDTC on the expression ofmRNA in Jurkat cells *P＜0.05，compared with the control group（0μmol／L）

3 討論

PDTC是一種氨基甲酸鹽類抗氧化劑，通過螯合金屬離子，清除活性氧中間產物（ROI）而發(fā)揮抗氧化作用。PDTC同時也是NF-κB特異性抑制劑，能夠通過阻止IκB的磷酸化降解，阻礙NF-κB的p65和p50亞基向細胞核內轉移等多種途徑抑制NF-κB的活化［10-15］。

本研究通過觀察不同濃度PDTC對Jurkat細胞增殖的抑制作用，闡明了PDTC可以通過抑制NF-κB的活性而抑制Jurkat細胞的生長。流式細胞術的結果進一步證實了PDTC可誘導Jurkat細胞凋亡，并可增強VCR的抗癌作用，且與劑量呈正相關。本研究通過半定量RT-PCR技術檢測了不同濃度PDTC處理后Jurkat細胞MMP-9的表達水平，證實PDTC可能通過抑制NF-κB的活性下調Jurkat細胞MMP-9基因的表達，進而誘導細胞凋亡，抑制白血病的浸潤轉移，降低白血病細胞的化療耐藥性，為臨床使用PDTC治療白血病提供了理論依據(jù)。

目前已證實，在肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤中NF-κB能夠促進MMP-9基因的表達［16-18］。相關體外研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性較高的癌細胞系通過上調MMP-9基因的表達水平及其活性的激活，而促進癌細胞的移動［19-20］。另有大量研究證實，MMP-9在白血病細胞跨內皮下基膜向髓外浸潤中起重要作用。

綜上所述，本研究為臨床上白血病的治療探索了一條新的途徑。白血病細胞中存在的MMP-9基因高表達，導致細胞基底膜及細胞外基質降解，促進了白血病的浸潤和轉移，并引起化療耐藥，而這一過程可被NF-κB抑制劑PDTC所抑制，這一發(fā)現(xiàn)對治療兒童難治性ALL具有重要參考價值。但ALL的發(fā)生、發(fā)展以及預后涉及到多個基因多條信號轉導途徑的異常激活，這些異常表達基因的具體作用及作用機制尚有待進一步深入研究。

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（編校：吳茜，劉路路）

Effect of PDTC，an inhibitor of NF-κB，on apoptosis and expression of MMP-9 in human acute lymphocytic leukem ia Jurkat cells

FU Li1，LIYe-cheng1，SU Yi1，SUN Hao-ping1，SHUAIYan-rong1，XIA Yan2

（1.Department of Hematology，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610083，China；2.Second Affiliated Hospital of Zhongshan University，Guangzhou 510120，China）

ObjectiveTo investigate the effect of PDTC，a specific inhibitor of NF-κB，on cell apoptosis of Jurkat cell and expression of MMP-9 in Jurkat cell，and investigate the relationship between NF-κB and MMP-9 in genesis，development，infiltration and metastasis of leukemia.MethodsJurkat cells in logarithmic growth phase were divided into six groups randomly，including control group in which the culturemedium was free of PDTC，and experimental groups in which Jurkat cellswere treated respectively with 50，100，150μmol／L of PDTC，1μg／mL of VCR，1μg／mL of VCR and 150μmol／L of PDTC.MTT assay was performed to evaluate the inhibition effect of PDTC on the proliferation of Jurkat cells.The apoptosis rate of Jurkat cells induced by the PDTC with VCR were detected by FCM.The expression of MMP-9 in Jurkat cellswere detected by semi-quantitative RT-PCR.ResultsAfter being treated with different concentrations of PDTC，the proliferation inhibition rate of PDTC on Jurkat cell increased with the raise of PDTC concentration and time extension.However，after being treated with PDTC for 48 hours，there was no obvious growth of proliferation inhibition rate，which showed the inhibitory effect of PDTC depending on time and dose within a certain range of concentration and time.The experimental group with high dose of PDTC presented highest inhibitory effect.After being treated with PDTC for 48 hours，apoptosis rate of Jurkat cell increased with the raise of PDTC concentration.Apoptosis rate of experimental groups were significantly higher than control group（P＜0.05）. Compared with VCR group，the apoptosis rate of VCR＋PDTCwas significantly higher than VCR group（P＜0.05），which showed PDTC could enhance induction of VCR in the aspect of promoting apoptosis.After being treated with different concentrations of PDTC，levels of MMP-9 mRNA were detected by RT-PCR.The results showed that levels of MMP-9 mRNA in experimental groups were significantly lower than control group（P＜0.05）.Conclusion This study explores a new way for the clinical treatment of leukemia.The high expression of MMP-9 gene existed in leukemia cells leads to degradation of cellbasementmembrane and extracellularmatrix，promotes leukemic infiltration andmetastasis，causes chemotherapy resistance，and this process can be inhibited by PDTC.This discovery isworthy of reference for treatment of children with ALL.

NF-κB；PDTC；MMP-9；Jurkat cell

R725.5

A

1005－1678（2014）08－0008－04

國家自然科學基金（30872785）

付利，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：惡性血液病的診斷和治療，E-mail：fuli583904940＠126.com。