羅格列酮對(duì)肺腺癌裸鼠移植瘤化療增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉新福 尹 嬋 張 輝 孫建群 莊英幟

近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升，已躍居各種惡性腫瘤的首位。其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌，就診時(shí)65%以上的病例為Ⅲ、Ⅳ期，使得肺癌患者在診斷時(shí)能夠進(jìn)行手術(shù)的不足1/4，因此化療在肺癌的綜合治療中起著重要的作用。鉑類藥物是肺癌聯(lián)合化療方案中最常用的藥物，其中順鉑在聯(lián)合化療方案中占據(jù)著重要地位。然而順鉑的耐藥性和毒副作用是化療的主要障礙，是臨床上急需解決的問(wèn)題之一?；熢雒魟┑膽?yīng)用是克服腫瘤耐藥的重要策略。我們前期研究證實(shí)羅格列酮具有一定的化療增敏作用[1]。本實(shí)驗(yàn)將探討羅格列酮對(duì)人肺腺癌裸鼠移植瘤化療增敏作用，為化療增敏劑的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物及材料

人肺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢市)。Balb/c-nu雌性裸小鼠28只，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(合格證號(hào)碼：京質(zhì)字0052997)，由南華大學(xué)腫瘤研究所提供SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境。小牛血清為杭州四季青產(chǎn)品，RPMI-1640為GIBCOBRL公司產(chǎn)品，兔抗人PPARγ、bcl-2、caspase-3多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，光譜SP試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 A549細(xì)胞用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、95%濕度，且含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中，每天換液1次，每2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 建立動(dòng)物模型 BalB/C-nu品系裸鼠，鼠齡為6周，體重約16～18 g，實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)均在SPF條件下的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，顯微鏡下觀察，將單細(xì)胞懸液調(diào)整為細(xì)胞濃度為1×107/ml，每只裸鼠接種0.2 ml單細(xì)胞懸液于一側(cè)背部皮下，以皮下結(jié)節(jié)體積達(dá)100 mm3為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。觀察接種后裸鼠的成瘤情況，篩選成瘤裸鼠。

1.2.3 分組給藥 將成瘤的裸鼠隨機(jī)分成7組，每組4只，Ⅰ組給予生理鹽水0.2 ml； Ⅱ組給予順鉑1 mg/kg；Ⅲ組給予順鉑4 mg/kg；Ⅳ組給予羅格列酮10 mg/kg；Ⅴ組給予羅格列酮30 mg/kg；VI組給予羅格列酮10 mg/kg+順鉑1 mg/kg；Ⅶ組給予羅格列酮30 mg/kg+順鉑1 mg/kg，接種10天后給藥，采用隔天腹腔注射方法給藥，共8次。

1.2.4 觀察指標(biāo) 用藥期間，每4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)短徑，按通用標(biāo)準(zhǔn)公式[V(mm3)=L×W2×0.52]計(jì)算皮下移植瘤體積，于最后一次給藥后48 h脫頸臼處死各組裸鼠，剝離皮下移植瘤并稱瘤重，計(jì)算皮下移植瘤瘤重抑制率，瘤重抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)]×100%，按金氏公式計(jì)算q值，以評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥效應(yīng)。q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea+b為兩藥合用的抑制率，Ea和Eb為各藥單用的抑制率，若q<0.85說(shuō)明兩藥合用有拮抗作用，若0.851.15說(shuō)明兩藥合用有協(xié)同作用。

1.2.5 移植瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 將部分移植瘤組織固定于10 %的中性福爾馬林液中 24 h 后，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋，切片。經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 腫瘤標(biāo)本用4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片(5 μm)，免疫組化染色檢測(cè)PPARγ、bcl-2、caspase-3的表達(dá)。采用免疫組化SP法檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(皆為1∶50稀釋為工作液)，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。應(yīng)用Image Pro Plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析，測(cè)出陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(integrated optical density IOD)，積分光密度是陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度與其面積的乘積，可以反映蛋白表達(dá)量(IOD值越高，其蛋白含量越高)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人肺癌A549裸鼠皮下移植瘤模型的建立

接種后第4天，可見(jiàn)接種部位小結(jié)節(jié)，接種后第5天，見(jiàn)接種部位小結(jié)節(jié)稍增大，約5 mm×5 mm大小，隨后結(jié)節(jié)逐漸增大，至第10天，約10 mm×10 mm大小。28只裸鼠全部成瘤，成瘤率達(dá)100%。

2.2 裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)觀察

移植瘤組織常規(guī)切片HE染色，光鏡下可見(jiàn)癌組織成片狀或彌散分布，浸潤(rùn)間質(zhì)，癌細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核漿比例失調(diào)，異型性明顯，可見(jiàn)病理性核分裂，細(xì)胞大小不等，其間偶見(jiàn)腺管、腺腔樣結(jié)構(gòu)，各組移植瘤組織中可見(jiàn)壞死細(xì)胞。

2.3 ROZ與DDP合用對(duì)人肺癌A549裸鼠移植瘤瘤體積的影響

用藥期間，每隔4天測(cè)量一次瘤體積，初始瘤體積組間比較無(wú)差異性，均衡性較好，具有可比性。經(jīng)處理后各用藥組從給藥第8天后瘤體積明顯小于對(duì)照組(P<0.01)，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，差異性更明顯(P<0.001)，其中30 mg/kg羅格列酮和1 mg/kg順鉑聯(lián)合組與對(duì)照組比較，差異最明顯(P<0.001)(表1)。

表1 ROZ與DDP合用對(duì)人肺癌裸鼠皮下移植瘤瘤體積的影響

注：*、**均為與對(duì)照組比較P<0.01，***為與對(duì)照組比較P<0.001。

2.4 ROZ與DDP合用對(duì)人肺癌A549裸鼠移植瘤瘤重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各用藥組瘤重明顯輕于對(duì)照組(P<0.01)，DDP低劑量+ROZ 低劑量和DDP低劑量組+ROZ高劑量組抑瘤作用進(jìn)一步增強(qiáng)，抑瘤率分別為52.11%和83.80%，q值分別為0.91和1.29，見(jiàn)表2。

2.5 免疫組化檢測(cè)各組移植瘤皮下腫瘤內(nèi)PPARγ、bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，PPARγ以移植瘤胞質(zhì)表達(dá)為主，呈棕黃色和褐色。定量分析，羅格列酮單獨(dú)組與對(duì)照組比較，PPARγ、caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，bcl-2表達(dá)下降，差異有顯著性(P<0.05)，聯(lián)合用藥組與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異更顯著(P<0.01)，見(jiàn)表3。

組別與劑量/mg·kg-1瘤重/mg抑瘤率/%q對(duì)照組283.98±35.37――DDP 1197.70±88.69a30.28―DDP 496.50±19.76b65.85―ROZ 10175.02±5.37a38.38―ROZ 30142.83±44.54b49.65―DDP 1+ROZ 10135.7±25.27bc52.110.91DDP 1+ROZ 3045.70±9.65bc83.801.29

注：a為與對(duì)照組比較P<0.01； b為與對(duì)照組比較P<0.001；c為與低劑量順鉑組比較，P<0.05。

表3 免疫組化檢測(cè)各組皮下腫瘤內(nèi)PPARγ、bcl-2、caspase-3的表達(dá)情況

注：a為與對(duì)照組比較，P<0.05；b 為與對(duì)照組比較，P<0.001。

3 討論

過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferator-activated receptors， PPARs)是屬于核激素受體超家族的新成員，1990 年首次由英國(guó)科學(xué)家Issemann和Green從小鼠肝克隆成功，目前鑒別出3個(gè)亞型(α、β、γ)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)、功能及組織分布上均有差異，其中生物學(xué)功能最復(fù)雜和研究最多的是 PPARγ。PPARγ在許多惡性腫瘤(如脂肪肉瘤、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌)中呈高度表達(dá)。近年來(lái)研究表明，經(jīng)配體激活后PPARγ參與脂肪細(xì)胞分化、調(diào)控細(xì)胞周期、抑制炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等作用[2-3]。羅格列酮是PPARγ人工合成配體。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PPARγ配體羅格列酮具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡的作用[4-6]，而且羅格列酮可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性[7]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：羅格列酮和順鉑用藥組均對(duì)移植瘤腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，順鉑1 mg/kg組加用不同劑量的羅格列酮后瘤重和瘤體積均低于順鉑1 mg/kg單用組，加用羅格列酮?jiǎng)┝吭礁撸鲋睾土鲶w積越低，瘤重抑制率越大，呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。兩藥聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)，30 mg/kg羅格列酮與1 mg/kg順鉑聯(lián)合組q值大于1.15，說(shuō)明羅格列酮與順鉑有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，即羅格列酮具有化療增敏效應(yīng)。而10 mg/kg羅格列酮與1 mg/kg順鉑聯(lián)合組q值等于0.91，說(shuō)明兩藥合用有相加作用，這表明兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果跟羅格列酮的劑量有關(guān)。這為臨床上選擇藥物劑量，發(fā)揮較好療效提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)所選用的動(dòng)物為常用的、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤動(dòng)物Balb/c-nu雌性裸鼠，它是1種無(wú)胸腺的先天性 T 細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物，將A549細(xì)胞分別接種到裸鼠后，裸鼠成瘤率高，達(dá)到100%(28/28)，這與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[8]。移植瘤的大體形狀多為圓形或多邊形，與周圍組織分界清楚；鏡下觀察移植瘤組織切片發(fā)現(xiàn) A549移植瘤細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有發(fā)生改變，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的動(dòng)物模型是成功的，可用于本實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)橹苯硬捎萌梭w腫瘤接種于動(dòng)物模型，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠，大大提高其與臨床的符合率。

Bcl-2是1種較為肯定的抗細(xì)胞凋亡基因，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。近來(lái)有很多報(bào)道表明，caspase蛋白酶家族在凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。其中caspase-3的激活是多種刺激引起凋亡的匯集點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞中caspase-3激活或表達(dá)升高可引起腫瘤的生長(zhǎng)抑制以及抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和演進(jìn)過(guò)程。Kang等報(bào)道[9]，PPARs配體環(huán)格列酮、曲格列酮和15-脫氧-前列腺素J2(15d-PGJ2)通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而呈劑量依賴方式抑制黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)，Western blot 分析環(huán)格列酮處理的黑素細(xì)胞組caspase-3表達(dá)呈時(shí)間依賴方式上調(diào)，而抗凋亡bcl-2表達(dá)卻呈時(shí)間依賴方式下調(diào)。Liu等[10]以15d-PGJ2和TGZs處理人白血病U937 和 Mono Mac 6 2種細(xì)胞，也得到了相同的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化證實(shí)PPARγ在人肺腺癌裸鼠移植瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，低、高劑量羅格列酮組和聯(lián)合用藥組較對(duì)照組比較，PPARγ、caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，而bcl-2的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)。低、高劑量羅格列酮與低劑量順鉑組合用后，該調(diào)節(jié)作用較單獨(dú)使用組明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，提示羅格列酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，其機(jī)制可能是羅格列酮激活了PPARγ受體，抑制bcl-2表達(dá)，激活caspase-3途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示PPARγ人工合成配體羅格列酮有望成為1種非小細(xì)胞肺癌治療的化療增敏劑。

[1] 劉新福，莊英幟，曹建國(guó)，等.羅格列酮增強(qiáng)順鉑對(duì)肺腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(12)：1667-1671.

[2] Hojka A，Rapak A.Peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR).Antiproliferative properties〔J〕.Postepy Hig Med Dosw(online)，2011，65：404-413.

[3] Bloch O，Sughrue ME，Mills SA，et al.Signaling pathways in cranial chondrosarcoma： potential molecular targets for directed chemotherapy〔J〕.J Clin Neurosci，2011，18(7)：881-885.

[4] Gottfried E，Rogenhofer S，Waibel H，et al.Pioglitazone m- odulates tumor cell metabolism and proliferation in multicellular tumor spheroids〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2011，67(1)：117- 126.

[5] Toaldo C，Pizzimenti S，Cerbone A，et al.PPARgamma ligands inhibit telomerase activity and hTERT expression through modulation of the Myc/Mad/Max network in colon cancer cells〔J〕.J Cell Mol Med，2010，14(6A)：1347-1357.

[6] Cimen I，Astarci E，Banerjee S.15-lipoxygenase-1 exerts its tumor suppressive role by inhibiting nuclear factor-kappa B via activation of PPAR gamma〔J〕.J Cell Biochem，2011， 112(9)：2490-2501.

[7] 胡劍鋒，張 琍.羅格列酮逆轉(zhuǎn)絲裂霉素對(duì)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞株耐藥的作用〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2013，28(1)：1-4.

[8] 黃 宏，張珍祥，徐永健，等.制滴菌素A治療人肺腺癌細(xì)胞A549裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，32(4)：403-405.

[9] Kang HY，Lee JY，Lee JS，et al.Peroxisome proliferator-activated receptors-gamma activator，ciglitazone，inhibits human melanocyte growth through induction of apoptosis〔J〕.Arch Dermatol Res，2006，297(10)：472-476.

[10] Liu JJ，Liu PQ，Lin DJ，et al.Downregulation of cyclooxygenase-2 expression and activation of caspase-3 are involved in peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists induced apoptosis in human monocyte leukemia cells in vitro〔J〕.Ann Hematol，2007，86(3)：173-183.