喉癌組織中腫瘤出芽與血管內(nèi)皮生長因子-C表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

高立生 高 珊 霍 峰 宋有鑫 齊志偉 畢 靜 徐 勤

(承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院,河北 承德 067000)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，其發(fā)病率逐年上升，腫瘤侵襲性癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成為影響其預(yù)后的主要原因。腫瘤出芽是腫瘤侵襲性判斷的重要特征，可作為腫瘤發(fā)展的預(yù)判指標(biāo)〔1〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可調(diào)節(jié)胚胎組織淋巴管生成的因子，是最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子。本文檢測喉鱗癌組織中腫瘤出芽、VEGF-C表達(dá)及其與微淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探尋能夠快速準(zhǔn)確預(yù)判喉癌發(fā)生發(fā)展過程中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效方法。

1 資料與方法

1.1材料 60例喉癌組織取自2006年6月至2011年12月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科住院手術(shù)60例原發(fā)喉鱗癌患者。術(shù)前均未接受放、化療，標(biāo)本為手術(shù)切除后1 h內(nèi)獲得，標(biāo)本獲得后經(jīng)10％甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片。所有標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診。其中男52例，女8例；年齡42～74歲，中位年齡60歲，<60歲33例，≥60歲27例；采用2010年國際抗癌協(xié)會(UICC)公布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期24例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的38例(有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移根據(jù)術(shù)后病理而定)；聲門上型30例，聲門型30例；發(fā)病前吸煙史20年以上(>20支/d)者48例為吸煙組，余12例為對照組；癌腫<3 cm者40例，癌腫≥3 cm者20例；高分化(G1級)35例，中低分化(G2級～G3級)25例。

1.2試劑和儀器耗材 兔抗人VEGF-C多克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤出芽采用組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色后鏡下判斷，判斷標(biāo)準(zhǔn)：在腫瘤浸潤前沿可見孤立單個的癌細(xì)胞或5個以下癌細(xì)胞組成的小癌細(xì)胞群，即判斷腫瘤出芽，否則即判斷無腫瘤出芽〔2〕。免疫組織化學(xué)SP法，相應(yīng)每例標(biāo)本解凍后經(jīng)甲醛固定24 h 內(nèi)行石蠟包埋,連續(xù)切取切片3張,分別進(jìn)行VEGF-C和D2-40染色石蠟切片(5 μm)，常規(guī)脫蠟至水，3％過氧化氫室溫孵育10 min，抗原修復(fù)15 min，室溫放置40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，小牛血清封閉10 min，滴加一抗 (1∶100工作液)4℃過夜，PBS沖洗，加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗，HE復(fù)染，透明，封片，鏡檢。

1.4結(jié)果判定 VEGF-C主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核(多數(shù)在胞質(zhì))，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知喉癌陽性組織切片為陽性對照。采用Volm雙評分法進(jìn)行判定在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5個高倍鏡視野(×200):①按染色陽性細(xì)胞百分率(A值)評分：陰性為0分，<25％為1分，25％～50％為2分，>50％為3分；②按染色強(qiáng)度(B值)評分：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合A值與B值判斷結(jié)果，陰性：0分，陽性：1～6分。以上結(jié)果的判定均由兩位不知患者臨床病理資料的病理科醫(yī)師進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤出芽、VEGF-C蛋白在喉癌組織的表達(dá) 在60例喉癌組織標(biāo)本中，HE染色觀察腫瘤出芽為喉癌組織浸潤前沿見到孤立單個的癌細(xì)胞或5個以下癌細(xì)胞組成的小癌細(xì)胞群，出芽的癌細(xì)胞呈梭型或多邊形，細(xì)胞核深染具有異型性，胞質(zhì)豐富且呈嗜酸性。60例喉癌組織標(biāo)本中腫瘤出芽檢出率58.33％，其中22例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中腫瘤出芽20例，檢出率靈敏度90.91％。免疫組化切片中，VEGF-C陽性表達(dá)率為68.33％，且主要分布于腫瘤浸潤邊緣。喉癌組織中腫瘤出芽與VEGF-C二者呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。其中VEGF-C陽性時，腫瘤出芽陽性30例，陰性11例；VEGF-C陰性時，腫瘤出芽陽性5例，陰性14例。腫瘤出芽及VEGF-C表達(dá)符合率73.33％。見圖1。

A

B

2.2腫瘤出芽、VEGF-C蛋白表達(dá)與喉癌臨床病理因素間的關(guān)系 喉癌組織中腫瘤出芽與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05)，與臨床分期、分化程度、腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無相關(guān)性(均P>0.05)；VEGF-C表達(dá)與喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度密切相關(guān)(均P<0.05)，與喉癌患者腫瘤大小、吸煙量、年齡及性別無相關(guān)性(均P>0.05)。見表1。

表1 喉癌組織中腫瘤出芽、VEGF-C表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系〔n(％)〕

3 討 論

腫瘤出芽為實(shí)質(zhì)性腫瘤組織浸潤前沿見到孤立單個的癌細(xì)胞或5個以下癌細(xì)胞組成的小灶性癌細(xì)胞群，出芽的癌細(xì)胞呈梭型或不規(guī)則形，細(xì)胞核深染且具有明顯的異型性，胞質(zhì)豐富且呈嗜酸性〔3〕。研究人員近年來通過對宮頸癌、口腔鱗癌及胃癌組織檢測，認(rèn)為有腫瘤出芽的實(shí)質(zhì)性腫瘤，即使該患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，仍具有很高的侵襲性及轉(zhuǎn)移風(fēng)險，提出了腫瘤出芽可以作為判斷實(shí)質(zhì)性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)的推論〔4,5〕。

VEGF-C被認(rèn)為是目前已知最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子，高表達(dá)可促進(jìn)淋巴管增生及淋巴道轉(zhuǎn)移〔6〕。VEGF-C具有高度特異性的血管內(nèi)皮分裂原，可誘導(dǎo)血管新生病增加新生血管的通透性。VEGF-C可能通過促進(jìn)淋巴管形成并增生，從而增加淋巴管與腫瘤細(xì)胞接觸面積使之利于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，同時通過淋巴管數(shù)目的增加及接觸面積的加大產(chǎn)生擠壓現(xiàn)象使淋巴管通透性和腫瘤間質(zhì)間的壓力增加，新生淋巴管與原有淋巴管增生擴(kuò)張融合，形成淋巴管網(wǎng)，更利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管及靜脈血管〔7〕。VEGF-C在增強(qiáng)腫瘤和周圍組織親和力的同時，還扮演著趨化因子的角色，促進(jìn)癌細(xì)胞向淋巴管方向移動〔8〕，另外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生大量的VEGF-C，與自身的受體(VEGFR)-3結(jié)合，使之磷酸化，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮生成并使腫瘤細(xì)胞通過新生淋巴管轉(zhuǎn)移至相應(yīng)區(qū)域，引起腫瘤高轉(zhuǎn)移率〔9〕。而VEGF-C還可以通過降低癌細(xì)胞與胞外基質(zhì)黏附性，使之易脫落“游走”，促進(jìn)其侵襲性〔10〕。Wiericnkx等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣區(qū)LMVD增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kimura等〔12〕發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者術(shù)前血清VEGF-C水平明顯高于健康人，且術(shù)后復(fù)發(fā)者血清VEGF-C水平顯著高于無復(fù)發(fā)者，認(rèn)為術(shù)前VEGF-C高水平含量是腫瘤復(fù)發(fā)獨(dú)立危險因素。Tes等〔13〕在喉鱗癌組織中通過免疫組化檢測到VEGF-C高表達(dá)，且VEGF-C與喉鱗癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，腫瘤出芽可能通過提高癌細(xì)胞外基質(zhì)代謝，使癌周環(huán)境改變難以繼續(xù)生長，降低細(xì)胞間質(zhì)黏附性，促使癌細(xì)胞向外周侵襲轉(zhuǎn)移尋找生長空間；腫瘤出芽可能還通過釋放VEGF-C促進(jìn)前沿區(qū)域微淋巴管形成，制造轉(zhuǎn)侵襲移的“通道”，所以腫瘤出芽的出現(xiàn)可以看成喉癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的前奏。同時，VEGF-C通過表達(dá)增高刺激周圍淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目和面積增生，從而擠壓遷移促進(jìn)癌組織中腫瘤微淋巴管大量生成及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。提示在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中腫瘤出芽和VEGF-C協(xié)同發(fā)揮了重要作用機(jī)制，這與Vered 等〔14〕的研究結(jié)論大概一致。

本實(shí)驗(yàn)提示腫瘤出芽和VEGF-C可作為喉癌轉(zhuǎn)移及負(fù)向預(yù)后的預(yù)判標(biāo)準(zhǔn)。如能通過某種途徑抑制腫瘤出芽和VEGF-C過度表達(dá)，可減少癌細(xì)胞通過淋巴道轉(zhuǎn)移的概率，對于喉鱗癌治療將有主要意義。

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