食管鱗癌組織中樹突細(xì)胞CD83和促凋亡蛋白Smac的表達(dá)及其臨床意義

王 雷 單保恩 劉 亮 孟憲利 王士杰

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011)

樹突細(xì)胞(DC)是機體功能最強的抗原專職遞呈免疫細(xì)胞(APC)，能攝取、加工提呈抗原，刺激T細(xì)胞增殖分化。一個DC 細(xì)胞能活化100～3 000個T細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，對激發(fā)抗腫瘤免疫有重要作用〔1～3〕。腫瘤浸潤樹突細(xì)胞(TIDC)，它的數(shù)量和功能可以反映機體的免疫狀態(tài)。研究腫瘤組織微環(huán)境中DC的免疫功能有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的原因和開展DC疫苗的治療研究，對于闡明食管癌免疫逃逸機制，探索行之有效的生物治療手段具有重要的理論與實踐意義。目前在食管鱗癌(ESCC)組織中TIDC的研究較少。細(xì)胞凋亡主要的途徑包括死亡受體途徑和線粒體途徑,這兩條途徑都有Caspases 家庭成員的參與。Smac是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種由線粒體釋放的促進(jìn)凋亡的蛋白，可以特異性與凋亡抑制蛋白(IAP)結(jié)合，解除 IAP 對Caspase 的抑制，從而促進(jìn)凋亡〔4〕。本研究探討 TIDC 和Smac 在食管癌組織中的表達(dá)及兩者的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2002年5月至2003年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的ESCC患者78例，術(shù)前均未行化療、放療或者其他治療。其中男49例，女29例，年齡39～71歲，中位年齡54歲。根據(jù)UICC ESC國際臨TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(1997)：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期44例。24例正常食管黏膜組織作為對照。

1.2試劑 鼠抗人CD83單克隆抗體購自eBioscience公司，兔抗人 Smac單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3ESCC組織單細(xì)胞懸液的制備和流式細(xì)胞儀檢測 將石蠟包埋組織在切片機上切取40 μm厚的組織片5片。加入二甲苯6 ml(室溫)，1 d后更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯；再依次加入100％、95％、70％、50％梯度的酒精5 ml，每步10 min，加入蒸餾水5 ml，用網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液100 μl(含1×106個細(xì)胞)，分別加入CD83 單抗和Smac單抗20 μl，室溫避光放置2 h，流式細(xì)胞儀檢測。檢測前以flow-checkTMFluorpheres(10 μm)熒光微球校準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1CD83和Smac在正常食管黏膜和ESCC組織中的表達(dá) CD83在正常食管黏膜中及ESCC組織中的表達(dá)量分別為19.70±6.79和13.39±8.78，兩者差異顯著(P<0.01)；Smac 在正常食管黏膜中及ESCC組織中的表達(dá)量分別為64.83±8.35和47.99±19.97，兩者差異顯著(P<0.01)。

2.2CD83和Smac表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系 CD83表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，與浸潤深度、分化程度、年齡和性別無關(guān)(P均>0.05)。Smac表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和浸潤深度有關(guān)(P均<0.01)，與分化程度、年齡和性別無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 Smac和CD83在ESCC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

2.3CD83和Smac在ESCC表達(dá)的相關(guān)性 Pearson法顯示CD83和Smac在ESCC表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.297，P<0.05)。

3 討 論

機體內(nèi)存在復(fù)雜的腫瘤免疫逃逸機制，致使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。該機制既有腫瘤細(xì)胞方面的因素，又有宿主免疫系統(tǒng)方面因素。其中荷瘤宿主體內(nèi)DC的異常是腫瘤免疫逃逸機制的一個重要方面，TIDC的浸潤程度反映了宿主防御機制所處的狀態(tài)，TIDC數(shù)量減少和功能低下或缺陷，不能有效提呈腫瘤抗原和提供協(xié)同刺激信號，以致T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫不能有效發(fā)揮作用〔5～7〕。

腫瘤細(xì)胞存在各種逃避機體免疫監(jiān)視和免疫控制的機制，不同狀態(tài)的機體免疫能不同程度地對腫瘤產(chǎn)生抑制作用。研究表明，DC可以通過如下途徑抑制腫瘤：①作為高效抗原提呈細(xì)胞(APC)，通過激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)等細(xì)胞釋放穿孔素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫致使腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡；②DC釋放一氧化氮(NO)或直接表達(dá)腫瘤壞死因子家族細(xì)胞因子，直接引起腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡；③直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖。成熟DC能有效提呈抗原和提供協(xié)同刺激信號，活化T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，CD83分子是DC的成熟標(biāo)記，因此CD83的表達(dá)量更能反映腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)。Iwamoto等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)CD83陽性表達(dá)的TIDC的數(shù)量與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后無關(guān)，體現(xiàn)了乳腺癌組織中浸潤的成熟DC對患者預(yù)后的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)ESCC組織中CD83的表達(dá)低于正常食管黏膜組織，CD83的表達(dá)與ESCC臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，病程越晚，CD83表達(dá)量越低。食管癌組織內(nèi)成熟DC數(shù)量減少，可能是腫瘤免疫逃逸的重要因素。

Smac是Du等〔9〕發(fā)現(xiàn)的一種存在于線粒體并且調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì),主要通過與IAP作用促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Smac過表達(dá)可以抑制或減緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展。當(dāng) Smac封閉于線粒體或 Smac缺乏使其拮抗 IAP而促進(jìn)凋亡的作用減弱,則促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。已有研究顯示Smac在癌細(xì)胞中表達(dá)的缺乏可能抑制腫瘤的凋亡,延長腫瘤的生存。Yoo等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)約62％的癌組織中可見Smac表達(dá)，且不同的癌組織中Smac的表達(dá)有差異，在腎癌、肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性實體腫瘤中的研究均顯示它表達(dá)下調(diào)或缺失。Mizutani等〔11〕證實 Smac在肝癌中的表達(dá)下降,轉(zhuǎn)染 Smac cDNA可以增強順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)Smac在正常食管黏膜組織中的表達(dá)明顯高于在食管鱗癌組織的表達(dá)，并且與浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著病程進(jìn)展，Smac表達(dá)率呈下降趨勢，提示Smac的表達(dá)降低可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞的凋亡處于抑制狀態(tài)，從而有利于疾病進(jìn)展。

食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟的生物學(xué)行為改變的過程，是細(xì)胞增生與凋亡的動態(tài)平衡失調(diào)的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)CD83和Smac表達(dá)呈正相關(guān)，其原因可能是DC誘導(dǎo)的CTL及其分泌的細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的某些促進(jìn)凋亡的基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。隨著病程進(jìn)展，DC表達(dá)減少而且功能降低可能導(dǎo)致腫瘤組織中Smac表達(dá)減少，腫瘤細(xì)胞凋亡減少致使腫瘤進(jìn)展。

食管鱗癌的治療手段以手術(shù)切除為主，輔以化療和放療，但其遠(yuǎn)期療效仍不夠理想?；颊呔驮\時多數(shù)已發(fā)展為晚期，手術(shù)難以完全切除，而放、化療不僅對造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用，而且最終還可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。食管鱗癌組織內(nèi)成熟DC數(shù)量減少可能是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的原因之一。近年來腫瘤生物治療已成為腫瘤治療的一種新形勢，增強DC的抗原提呈功能及激活T細(xì)胞的能力，激發(fā)機體的特異性抗腫瘤免疫，是DC用于抗腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)和出發(fā)點〔12,13〕，DC疫苗活化CTL發(fā)揮抗瘤效應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫治療取得了初步成果〔14,15〕，這對食管癌的治療具有積極意義。

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