青蒿琥酯上調(diào)HO-1對老齡膿毒癥小鼠急性肝損傷的作用

曹天輝 費東生 潘尚哈 廉志遠 桂明國 趙鳴雁

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院ICU，黑龍江 哈爾濱 150001)

膿毒癥以及其誘發(fā)的膿毒性休克已成為當今重癥監(jiān)護病房(ICU)患者住院死亡率的重要原因〔1〕。老齡患者因機體抵抗力低下，器官功能減退，膿毒癥發(fā)生后的預后更差。在膿毒癥發(fā)生與形成過程中，肝臟是最容易受損的器官之一。血紅素氧合酶(HO)-1又稱熱休克蛋白32，是體內(nèi)血紅素代謝主要的起始酶與限速酶。在機體處于應激、創(chuàng)傷、炎癥反應以及缺血再灌注損傷時可以通過抗炎、抗氧化、抗凋亡起到對于機體的保護作用。青蒿琥酯(ART)是青蒿素的衍生產(chǎn)物，主要應用治療重癥瘧疾以及腦型瘧疾，相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)ART具有抗腫瘤以及一定的抗炎作用〔2〕，但對于其具體的抗炎機制并不十分清楚。本文旨在通過檢測ART干預后HO-1表達情況，探討ART對老齡膿毒癥小鼠急性肝損傷的作用機制，為其臨床防治膿毒癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 ART粉針劑購于桂林南藥股份有限公司，HO-1抑制劑鋅普林原IX(ZnPP IX)(sigma，美國)，小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6 ELISA檢測試劑盒購于藍基生物科技有限公司。Western印跡以及免疫組化抗體，兔抗小鼠HO-1多克隆抗體(Santa Cruz，美國)。

1.2方法

1.2.1動物模型及分組方法 72只雄性昆明小白鼠，18～22周鼠齡，體重25～30 g，由哈醫(yī)大一院動物實驗中心提供，小白鼠隨機分為假手術(shù)組(sham組)、膿毒癥組(CLP組)、ART干預組(ART組)、HO-1抑制劑(ZnPP)組，每組18只。各組小鼠分別按6、12、24 h處死時間點分為三個亞組，每組6只。sham組與CLP組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射等劑量生理鹽水，ART干預組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射ART(15 mg/kg)〔3〕，ZnPP組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射ART(15 mg/kg)后再注射ZnPP溶液(40 μmol/kg)。造模4 h后sham組、CLP組、ZnPP組分別給予生理鹽水1次，ART組給予等體積ART 1次。膿毒癥造模方法參照傳統(tǒng)CLP模型方法〔4〕，小鼠術(shù)前12 h禁食，自由進水，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定小鼠，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，于腹正中線做長約1 cm切口，打開腹膜，分離盲腸，用3～0絲線在距盲腸根部1/3處結(jié)扎，結(jié)扎后保持腸道通路正常，用7號針頭分別于盲腸近段和末端各穿一孔，避免穿刺出血，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。術(shù)后即刻背部皮下注射生理鹽水1 ml以補充術(shù)中液體流失〔5〕。假手術(shù)組僅做開腹，分離盲腸遠端，但不結(jié)扎不穿孔關(guān)腹。術(shù)后各組小鼠分籠飼養(yǎng)，不禁食不禁水。

1.2.2標本采集 分別于造模后6、12、24 h眼球取血法收集小鼠血液1 ml，3 000 r/ min，10 min離心后取上清于-80℃冰箱保存。取血后脫頸法處死小鼠，迅速打開腹腔，分離肝臟組織。取相同位置肝組織，一部分-80℃冰箱凍存，用于肝組織HO-1蛋白表達檢測。另一部分肝組織4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，以備光鏡下檢測肝臟病理學改變和免疫組化法檢測肝組織中HO-1表達情況。

1.3各項指標檢測 ①應用FR-40全自動生化分析儀檢測6、12、24 h血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。②ELISA法檢測6、12、24 h血清中TNF-α與IL-6水平，具體操作按ELISA試劑盒說明書要求進行。③Western印跡法檢測24 h HO-1在肝臟的表達。-80℃冰箱取出凍存肝組織，稱重30 mg，裂解液裂解，制備肝組織勻漿。提取蛋白并純化，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，各取40 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V、3 h電泳后轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，應用2％脫脂奶粉(PBS稀釋，pH7.14)4℃封閉1 h后滴加HO-1(1∶1 00稀釋)一抗過夜，次日3次洗膜后應用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后顯影、洗片。

1.4免疫組化法檢測24 h亞組HO-1在肝臟的表達 肝組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切厚度5 μm的切片后進行脫蠟，枸櫞酸鈉溶液抗原修復，過氧化氫抗原封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，HO-1兔抗小鼠多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，次日PBS沖洗3次，每次5 min，滴加羊抗兔二抗，37℃溫箱孵育1 h后PBS沖洗3次，DAB法顯色，蘇木素復染，光鏡200倍下觀察肝臟HO-1表達情況。

1.5肝組織24 h亞組病理學損傷情況 肝組織4％多聚甲醛固定后梯度酒精脫水，脫鈣后石蠟包埋，切片(切片厚度5 μm)，行HE染色，在光鏡200倍下觀察肝臟病理學變化。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清ALT、AST水平比較 sham組ALT、AST水平基本處于正常范圍，與sham組相比，CLP組小鼠各時相ALT、AST水平升高明顯(P<0.05)，以24 h亞組ALT、AST升高最為顯著。與CLP組相比，ART組血清ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)。與ART組相比，ZnPP組各時相ALT、AST水平升高(P<0.05)，ZnPP組與CLP組各時相ALT、AST表達水平相似。見表1，表2。

表1 各組小鼠血清ALT水平比較

表2 各組小鼠血清AST水平比較

2.2各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 sham組TNF-α、IL-6水平基本處于正常范圍。與sham組相比，CLP組小鼠各時相TNF-α、IL-6水平升高明顯(P<0.05)，以24h亞組TNF-α、IL-6升高最為顯著。與CLP組相比，ART干預可以顯著降低TNF-α，IL-6水平(P<0.05)。與ART組相比，ZnPP組各時相TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，ZnPP組與CLP組各時相TNF-α、IL-6表達水平相似。見表3，表4。

表3 各組小鼠血清TNF-α水平比較

表4 各組小鼠血清IL-6水平比較

2.3Western印跡法檢測24 h亞組HO-1在肝臟表達情況 Sham組HO-1幾乎沒有表達，CLP組臟HO-1表達水平較Sham組升高，可見清晰條帶(P<0.05)；與CLP組相比，ART組肝臟HO-1表達明顯升高(P<0.05)；與ART組相比，ZnPP組肝臟HO-1水平表達下降，但與CLP組表達水平相似。見圖1。

2.4免疫組化法檢測24 h亞組HO-1在肝臟表達情況 HO-1免疫組化陽性結(jié)果為黃染顆粒，HO-1表達在肝臟細胞質(zhì)中。sham組肝臟HO-1表達較少，CLP組肝臟HO-1表達增加，ART組肝臟HO-1表達明顯增多，ZnPP組肝臟HO-1表達與CLP組相似。見圖2。

2.5各組小鼠肝臟24 h亞組病理情況 光鏡下sham組肝組織無明顯病理損傷，肝實質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，無明顯充血，無炎性細胞浸潤，肝細胞無腫脹，無嗜酸性變性和壞死。CLP組肝細胞壞死腫脹，部分肝竇結(jié)構(gòu)不清晰，肝竇以及匯管區(qū)內(nèi)炎性細胞浸潤，可見充血壞死。ART組肝臟炎癥減輕，肝細胞變性、壞死減少，肝竇、匯管區(qū)炎性細胞浸潤減輕，充血減少。ZnPP組肝臟病理結(jié)果與CLP組相似。見圖3。

圖2 免疫組化法HO-1在肝臟表達情況(DAB，×200)

圖1 Western印跡法檢測肝臟HO-1表達情況

圖3 光鏡下肝臟病理學損傷情況(HE，×200)

3 討 論

膿毒癥是ICU老年患者死亡的重要原因〔6〕，可進展成嚴重膿毒癥、膿毒性休克甚至誘發(fā)多器官功能障礙。在受累器官中，肝臟是最常受損的器官之一。肝臟內(nèi)富含豐富的酶、凝血因子和組織蛋白質(zhì)，是機體合成、代謝、解毒的主要場所。當膿毒癥誘發(fā)肝臟功能受損時，機體會出現(xiàn)嚴重的甚至不可逆的結(jié)果〔7〕。膿毒癥發(fā)生時，機體會出現(xiàn)炎性因子過量釋放，補體的激活，氧化還原反應的失衡，凝血系統(tǒng)與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)的紊亂，上述因素共同作用使得單獨控制某方面因素無法有效抑制膿毒癥的進展。關(guān)于膿毒癥研究的各種假說很多，其中最為重要的一個假說為促炎與抗炎反應的失衡(SIRS/CARS)。膿毒癥發(fā)生早期主要是促炎因子的過度釋放，使得全身炎癥反應綜合征(SIRS)占據(jù)主導作用；而膿毒癥發(fā)生的晚期往往是因機體吞噬殺菌活性減弱，抗原遞呈功能受抑的代償性抗炎反應綜合征(CARS)作用的增強作為主導。因此能否控制炎癥反應的失衡，即在膿毒癥早期抑制過量炎性因子的釋放以及在膿毒癥晚期促進抗感染免疫功能的恢復是能否控制膿毒癥進展的重要因素之一。有研究顯示在動物實驗中通過上調(diào)抗炎因子IL-10以拮抗促炎因子的過度釋放起到了對于機體的保護作用。上調(diào)炎性因子IL-7能夠促進膿毒癥晚期免疫功能的恢復。同樣具有保護作用的不僅僅是一些抗炎因子，相關(guān)文獻研究證實通過外源性物質(zhì)作用體內(nèi)或通過誘導內(nèi)源性物質(zhì)的釋放可以減輕膿毒癥時的臟器損傷。外源性的物質(zhì)包括藥物，一些氣體分子例如氫氣(H2)、硫化氫(H2S)、一氧化碳(CO)等，而內(nèi)源性物質(zhì)包括Toll-4樣受體，乙酰膽堿酯能受體和一些酶類等。

HO-1正是在膿毒癥發(fā)生時保護機體的酶學之一。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，其分解血紅素的產(chǎn)物包括Fe2+，膽綠素以及CO。HO有三種同工酶，分別為HO-1、HO-2和HO-3。HO-2和 HO-3主要在生理情況下作用于體內(nèi)〔8〕，而HO-1在病理情況下釋放。大量文獻研究顯示HO-1及其代謝產(chǎn)物對于膿毒癥發(fā)生時的機體具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的保護作用。除血紅素外，某些重金屬、熱休克、高氧、低氧、紫外線輻射、內(nèi)毒素等均可誘導HO-1 的產(chǎn)生〔9〕。HO-1廣泛分布于各個組織中，在肝臟中HO-1的分布尤為明顯。當機體出現(xiàn)應激損傷時HO-1在肝臟表達大量上調(diào)，不僅僅分布于Kuffer細胞，在肝實質(zhì)以及間質(zhì)細胞中均有明顯表達。HO-1的上游調(diào)節(jié)產(chǎn)物活化蛋白-1(AP-1)以及核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)可以促進HO-1釋放〔10〕，HO-1通過核轉(zhuǎn)錄蛋白(NF)-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)下的P38、Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)等通路起到抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。Morse等〔11〕研究表明HO-1可以抑制NF-κB以及MAPK通路阻斷炎癥反應的發(fā)生，減輕TNF-α與IL-6的釋放。南川川等〔12〕研究表明HO-1對于膿毒癥小鼠血栓形成有抑制作用，并且HO-1能夠防止內(nèi)皮細胞損傷，減輕肝臟炎癥反應，促進肝臟凝血系統(tǒng)功能的恢復。Ryter等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以減少肝組織丙二醛(MDA)形成，促進肝臟超氧化物歧化酶(SOD)產(chǎn)生，修復肝組織中氧化還原反應的失衡，減輕膿毒癥時肝臟的氧化損傷。Ke等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以抑制Fas通路減輕肝損傷時肝細胞的凋亡。上述研究均已證實HO-1對于膿毒癥時受損肝臟的保護作用。

目前對于膿毒癥基礎(chǔ)研究與藥物研究都有很多，人們在研發(fā)一些新藥治療膿毒癥的同時，一些中醫(yī)中藥和一些傳統(tǒng)意義上的“老藥”也成為研究的新熱點。ART正是這些藥物中的一種，目前臨床主要應用于重癥瘧疾、腦型瘧疾和類風濕關(guān)節(jié)炎的治療中。ART對于耐藥性瘧疾的治療更是起到了良好效果，其在瘧疾治療的作用于地位目前尚無可替代。除此以外大量的研究發(fā)現(xiàn)ART具有良好的抗腫瘤作用，ART對于胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等均有較好的抗腫瘤效應，考慮其機制可能是調(diào)控氧化還原反應促進腫瘤細胞的凋亡〔15〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ART同樣具有抗炎作用，曹紅衛(wèi)等〔16，17〕研究報道ART對于膿毒癥大鼠急性肺損傷以及膿毒癥大鼠急性肝損傷均有保護作用，ART可以協(xié)同碳氫酶烯類抗生素發(fā)揮抗炎作用〔18〕。ART的免疫調(diào)節(jié)作用很早前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是對于ART更具體更深入的抗炎作用研究仍舊缺乏。ART是否通過某些具體通路減輕炎癥反應，起到減輕膿毒癥臟器損傷的作用。而本研究結(jié)果也部分揭示了ART的抗炎作用通路，發(fā)現(xiàn)了ART可以通過上調(diào)HO-1發(fā)揮抗炎作用。

本研究證實制備CLP模型可以誘發(fā)小鼠急性肝損傷的發(fā)生。肝臟病理學損傷在24 h最為明顯，肝臟中HO-1表達水平上調(diào)。而給予ART干預治療后小鼠血清炎癥因子水平下降，肝臟酶學損傷減輕，病理學中肝臟結(jié)構(gòu)清晰，肝竇以及匯管區(qū)充血減輕，炎細胞浸潤減少，肝細胞變性壞死損傷程度減輕。ART具有上調(diào)HO-1的作用。通常情況下，當炎癥反應發(fā)生時，機體自身會釋放內(nèi)源性HO-1起到受損臟器的保護作用，給予ART會上調(diào)HO-1的表達，起到外源性促進HO-1釋放作用。應用HO-1阻滯劑ZnPP后可以同時抑制機體內(nèi)源性與外源性HO-1的釋放。ART通過HO-1通路來減輕膿毒癥時炎癥反應、起到器官功能保護的作用。ART是青蒿素的衍生物，藥理作用相同，但ART是青蒿素的升級產(chǎn)品。青蒿素只能通過口服途徑給藥，而ART可以通過靜推以及肌注途徑給藥，這對危重病人更容易實現(xiàn)。盡管ART目前主要應用于重癥瘧疾以及腦型瘧疾的治療，但我們的研究通過動物模型證實ART也可能對其他原因?qū)е碌哪摱景Y(如腹腔感染等)治療有效，并從信號轉(zhuǎn)導通路上證實ART通過調(diào)節(jié)HO-1通路來發(fā)揮抗炎作用，也可能為后續(xù)研究提供有益幫助和借鑒。

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