多粘類芽孢桿菌LRS-1對辣椒疫霉菌脅迫下根系分泌物的影響

張亮袁紅 段良霞 羅雨晴 盛浩

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南長沙 410128）

根際土壤環(huán)境對作物生長具有特殊意義，是作物根系與土壤微生物互作最為密切的微生態(tài)圈，該域內(nèi)各類環(huán)境因子、根系分泌物以及微生物群落相互影響、相互制約，對作物生長起到至關(guān)重要的作用（Prashar et al.，2014；Finzi et al.，2015）。健康的根際土壤環(huán)境中，根系能夠分泌和沉淀各類有機(jī)物質(zhì)，為植物生長提供良好的營養(yǎng)來源，并促進(jìn)根際土壤中微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性的增長，產(chǎn)生和諧的根系效應(yīng)（Helmut et al.，2005；Singh &Mukerji，2006；Doornbos et al.，2012）。在土傳病害發(fā)生嚴(yán)重的根際土壤環(huán)境中，受病原菌脅迫影響，植物根系會發(fā)生防御性反應(yīng)，包括根系防衛(wèi)基因受病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)以及特異性物質(zhì)的表達(dá)分泌，同時受微生物“群體感應(yīng)”作用的影響，根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)及其數(shù)量會發(fā)生明顯的變化，以求克服或緩解植物根系乃至整個植株的生長障礙（Wu et al.，2009；Albuquerque &Casadevall，2012；Tommassen &W?sten，2015）。

辣椒疫霉病是由辣椒疫霉菌（）引發(fā)的世界性土傳病害，可導(dǎo)致田間種植或大規(guī)模栽培條件下辣椒產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失以及品質(zhì)顯著下降（Hausbeck &Lamour，2004）。多粘類芽孢桿菌LRS-1 由水稻土壤分離篩選獲得，前期試驗結(jié)果表明該菌株對包括辣椒疫霉病和黃瓜疫霉病在內(nèi)的土傳病害具有良好的防控效果（趙旖森 等，2019；張亮 等，2020）。本試驗從“疫霉菌—生防菌—根系化感”體系互作的角度對其生防機(jī)理予以解析，以期探明多粘類芽孢桿菌LRS-1 對疫霉病害脅迫條件下辣椒根系分泌物影響的作用機(jī)理，從而為深入認(rèn)識和防控該類土傳病害的發(fā)生及土壤微生態(tài)修復(fù)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、菌株與辣椒品種

試驗于2020 年3 月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院教學(xué)基地溫室進(jìn)行。供試土壤為第四紀(jì)紅色黏土母質(zhì)發(fā)育的潴育性水稻土，采集于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田耕作層。土壤基本理化性質(zhì)：全氮21.4 g · kg、有機(jī)質(zhì)27.67 g · kg、速效磷17.2 g ·kg、速效鉀74 g · kg、pH 值5.2。

供試病原菌為辣椒疫霉菌（）It263，保存于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。供試生防菌為多粘類芽孢桿菌（）LRS-1，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院土壤微生物實驗室。

辣椒品種為湘椒5 號，采購于長沙新萬農(nóng)種業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌NBY 液體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯粉8 g，葡萄糖2.5 g，酵母提取物2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，1 mmol · L七水合硫酸鎂1 mL，去離子水1 L。真菌培養(yǎng)基PDB：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L。PDA 培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基1 L，瓊脂15 g（張亮 等，2020）。

1.3 試驗設(shè)計

采用盆栽試驗，共設(shè)3 個處理，包括無病陰性對照（CK）、辣椒疫霉菌處理（PC）和多粘類芽孢桿菌+辣椒疫霉菌處理（LRS1）。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)8 盆（直徑15 cm）。

1.4 接種、病原土制備、育苗與盆栽方法

菌株接種：多粘類芽孢桿菌LRS-1 采用泥炭制備法（Khabbaz et al.，2015），即：盆栽前1 d，多粘類芽孢桿菌LRS-1 經(jīng)NBY 液體培養(yǎng)基于26℃、180 r · min振蕩培養(yǎng)48 h，6 000 r · min離心，生理鹽水懸浮（1 × 10CFU · mL），最后經(jīng)輻照滅菌泥炭粉配制為10%（∶）生防泥炭粉（1 × 10CFU · mL），備用。

病原土制備：辣椒疫霉菌It263 經(jīng)PDA 平板培養(yǎng)7 d 后，于菌落邊緣打孔，菌餅直徑為0.5 cm，并挑取16 塊菌餅于滅菌的培養(yǎng)皿中，加水淹過表面，每隔30 min 換水1 次，第4 次換水后將10 mL洗液注于滅菌的PDB 液體培養(yǎng)基并于26 ℃、180 r ·min黑暗條件下振蕩培養(yǎng)120 h，雙層滅菌紗布過濾，顯微鏡下利用血球計數(shù)板對游動孢子計數(shù)，與過20 目篩的健康水稻土按1∶10（∶）比例混合制備成感病盆栽土。

辣椒育苗：采用育苗盤和無土基質(zhì)在室內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行辣椒苗培育，每穴播種1～2 粒辣椒種子（表面消毒處理，即75%酒精+無菌水分別清洗2 次，每次30 s），常規(guī)管理至三葉一心期。

盆栽試驗：每盆加入600 g 感病土，并移入1株根部包裹有生防泥炭粉的辣椒苗（三葉一心期），以不接種的滅菌泥炭粉作為陰性對照。常規(guī)管理至第30 天進(jìn)行采樣。

1.5 采樣與根系分泌物收集

采樣與根系分泌物收集參照趙蘭鳳等（2013）的離位溶液培養(yǎng)法并略有改進(jìn)：辣椒植株正常管理至第30 天時，各處理隨機(jī)選取12 盆，將植株從土壤中拔出，先用自來水沖洗3～5 次，洗掉附著的土粒，之后用超純水沖洗2～3 次。將辣椒苗放置于5 mg · L百里酚溶液中浸泡3 min，以抑制微生物繁殖，再轉(zhuǎn)入50 mL 5 mmol · L氯化鈣溶液中來收集根系分泌物，每個收集瓶均放入4 株。連續(xù)收集根系分泌物16 h 后，經(jīng)定量濾紙過濾除掉脫落的根毛和雜質(zhì)，在20 ℃下保存?zhèn)溆茫ㄐ焱衩?等，2010）。

1.6 根系分泌物中有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的測定

將收集的根系分泌物原液直接用于有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的測定。有機(jī)酸含量采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定（袁釩淇 等，2019），蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 比色法（杜歡等，2017），可溶性糖含量測定采用苯酚-硫酸法（劉延吉 等，2006）。

1.7 根系分泌物的GC-MS 分析

吸取15 mL 根系分泌物收集液，加入等體積的乙酸乙酯提取根系分泌物，再將乙酸乙酯提取液過0.45 μm 膜，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45 ℃減壓濃縮至干，加入過0.45 μm 膜的乙酸乙酯2 mL，取1 μL作GC-MS 分析，提取液于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心測定。GC-MS 型號是Finnigam TRACE，離子源EI 70 eV，掃描質(zhì)量35～335 AMU，毛細(xì)管柱：HP-1NNOWAX 柱（30 m × 0.25 mm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱溫60 ℃（1 min），以5 ℃ · min程序升溫至120 ℃（保持2 min），再以10 ℃ · min程序升溫至250 ℃（保持10 min），載氣為He，流量為1 mL · min，進(jìn)樣量為1 μL（徐婉明 等，2010）。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 軟件統(tǒng)計分析，并采用SAS 9.1 進(jìn)行方差分析，顯著性水平采用Duncan’s 新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理根系分泌物的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)與可溶性糖含量

如表1 所示，根系分泌物中有機(jī)酸和可溶性糖含量高于蛋白質(zhì)含量，而有機(jī)酸與可溶性糖含量相差不大。不同處理的根系分泌物中有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、可溶性糖含量存在差異。就根系分泌物中有機(jī)酸含量而言，辣椒疫霉菌處理（PC）有機(jī)酸含量最高，較無病陰性對照（CK）增加了80.5%且差異顯著，而多粘類芽孢桿菌+辣椒疫霉菌處理（LRS1）的有機(jī)酸含量與對照無顯著差異，說明辣椒疫霉菌脅迫能夠顯著增加根系分泌物中有機(jī)酸含量，而接種生防菌LRS-1 能顯著降低該脅迫對根系有機(jī)酸分泌的影響。各處理可溶性糖含量差異顯著，具體表現(xiàn)為PC ＞ LRS1 ＞ CK，其中PC 處理較CK 增加了69.3%，較LRS1 處理增加了31.2%，說明辣椒疫霉菌脅迫能顯著增加根系分泌物中可溶性糖含量，而接種多粘類芽孢桿菌LRS-1 能緩解該脅迫對根系可溶性糖分泌的影響。與CK 相比，PC 處理和LRS1 處理根系分泌物中蛋白質(zhì)含量均顯著提高，分別提高了26.3%和45.8%，說明疫霉菌脅迫與接種生防菌均能誘導(dǎo)根系提高其抗逆性，這可能與植物獲得性系統(tǒng)抗性（SAR）和誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR）有關(guān)。

表1 不同處理根系分泌物有機(jī)酸、蛋白質(zhì)與可溶性糖含量μg · mL-1

2.2 根系分泌物的GC-MS 分析

圖2 PC 處理GC-MS 檢測結(jié)果

圖3 LRS1 處理GC-MS 檢測結(jié)果

如圖1～3 所示，GC-MS 鑒定結(jié)果顯示各處理色譜圖柱峰分布情況不同，且有效命名了25 種物質(zhì)（表2）。檢測到的根系分泌物主要為酯類、酸類、胺類、醇類、酮類和烴類化合物等，且以結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜的酯類、酸類和胺類化合物較多，以直鏈或支鏈烷烴為主的烴類和醇類化合物較少。處理間成分比較得知，辣椒根系分泌物的共有化合物為17 種，分別是3，3-二甲基已烷、N，N-二丁基-甲酰胺、3-苯基-2-丙烯酸甲酯、羥基-苯丙酸甲酯、月桂酸甲酯、羥基-苯丙酸甲酯、月桂酸、松香酸、十五烷酸、十六烷、2-羥基環(huán)十五烷酮、N-（乙氧甲基）-2 氯代-乙酰胺、乙醇胺、油酰胺、2-乙基對二甲苯、3-正丁烯基苯酞、γ-4-二甲基苯丁醛。

圖1 無病陰性對照GC-MS 檢測結(jié)果

表2 不同處理辣椒根系分泌物成分類型及含量

所有成分中，月桂酸的相對豐度最大，遠(yuǎn)大于其他化合物，其中CK 的月桂酸含量比其他2 個處理要高，達(dá)到了7.40%。與PC 處理相比，CK 與LRS1 處理的共有化合物種類有所減少，未檢測到棕櫚酸甲酯、1，2，3，5-四甲基苯、蘋果酸、2-乙基己醇、2，6-二叔丁基對甲酚、亞油酸乙酯、2，3-二甲基萘、β-谷甾醇等化合物，說明上述分泌物成分可能為疫霉菌逆境下辣椒根系化感的特有成分，也證實了接種多粘類芽孢桿菌LRS-1 能夠維系辣椒根系代謝的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，較好地抵御了疫霉菌對辣椒根系化感的負(fù)面影響。

3 討論與結(jié)論

在土壤生態(tài)環(huán)境中根系分泌物會對植物生長產(chǎn)生影響，這種影響使得根系分泌物在其中扮演著兩種角色，一方面能夠穩(wěn)定保持土壤生態(tài)平衡，積極調(diào)整植物與土壤微生物之間的相互作用，另一方面又能作為化感自毒性物質(zhì)降低土壤的免疫力，誘導(dǎo)病原菌侵染導(dǎo)致植物發(fā)?。℉uang et al.，2014）。因此，了解根系分泌物對生物逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)理對防控疫霉病等土傳病害具有重要意義。

本試驗結(jié)果表明，疫霉菌脅迫條件下辣椒根系分泌物中有機(jī)酸和可溶性糖含量顯著增加，而接種多粘類芽孢桿菌LRS-1 則對該現(xiàn)象有所緩解。大量研究表明，有機(jī)酸與可溶性糖作為根系分泌物中重要組成成分，既有顯著的生態(tài)功能，又能夠刺激病原微生物的生長，加劇土傳病害的發(fā)生，所以有機(jī)酸與可溶性糖的含量一定要在特定的范圍內(nèi)（董艷 等，2016）。Liu 等（2015）研究證明，在特定的濃度范圍內(nèi)苯丙酸對青枯菌的生長有一定的影響，從而發(fā)現(xiàn)青枯病發(fā)生的重要原因之一可能是煙田連作導(dǎo)致了有機(jī)酸含量的增加。郝文雅等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，西瓜根系分泌物中含量高的糖能夠給其致病菌提供營養(yǎng)，而感病西瓜品種可溶性糖含量和種類都很高，能夠促進(jìn)病原菌的繁殖，與之相反，水稻根系分泌物的低糖供給卻能降低西瓜對病原菌的營養(yǎng)供給。相關(guān)研究已經(jīng)證實，無論是病原菌引發(fā)的植物獲得性系統(tǒng)抗性（SAR），還是功能菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR），均能不同程度刺激植物分泌大量病程性蛋白類物質(zhì)，從而提高植物對逆境的防御能力（Pieterse et al.，2014）。本試驗顯示，接種多粘類芽孢桿菌LRS-1 對辣椒根系分泌物蛋白質(zhì)類含量具有顯著提升效果，這與前人研究結(jié)果相符。

根據(jù)一些化感作用理論，部分水溶性有機(jī)酸、長鏈脂肪酸、苯甲酸及其衍生物、烴類及其衍生物等低分子有機(jī)化合物均具有化感作用，被認(rèn)為是化感物質(zhì)（Rice，1990）。本試驗發(fā)現(xiàn)，雖然不同處理辣椒根系分泌物的化學(xué)成分存在一定差異，但是根系分泌物中酸類、醇類、酮類、烴類等化合物均具有化感作用，而烴類、酸類和酯類本身及其次生代謝產(chǎn)物具有一定的化感作用，能夠抑制或刺激其他作物生理生化反應(yīng)以及對土壤中微生物產(chǎn)生影響（張照然 等，2013）。疫霉菌脅迫下辣椒化合物成分種類較對照明顯增多，并檢測到諸如棕櫚酸甲酯、1，2，3，5-四甲基苯、蘋果酸、2-乙基己醇、2，6-二叔丁基對甲酚、亞油酸乙酯、2，3-二甲基萘和β-谷甾醇等特異性化合物成分，接種多粘類芽孢桿菌使得無病陰性對照與LRS1 處理間的化合物種類及含量差異不大，而3-苯基-2-丙烯酸甲酯等化合物在接種了LRS-1 處理的辣椒根系分泌物中相對含量最高，且明顯高于對照和PC 處理，疫霉菌對辣椒根系化感作用的脅迫影響得到有效抑制。

綜上，本試驗不僅揭示了疫霉菌脅迫環(huán)境下生防菌對寄主植物根系化感脅迫的抑制效應(yīng)，完善了多粘類芽孢桿菌LRS-1 防治辣椒疫霉病等土傳病害的作用機(jī)理，也為土壤健康生物防控提供了必要的理論參考依據(jù)。