番茄頸腐根腐病研究進(jìn)展

蘇曉梅 朱春宇，2 劉淑梅 王施慧 呂宏君 侯麗霞*

〔1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站（山東），山東濟(jì)南 250100；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京100193〕

番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，F(xiàn)CRR）是由尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；停╢.sp.-，F(xiàn)orl）侵染引起的土傳性真菌病害，在設(shè)施生產(chǎn)中多有發(fā)生并逐年嚴(yán)重。近年來，隨著番茄設(shè)施栽培面積增大及種植年限增加，頸腐根腐病已成為影響番茄收益的重要病害之一。然而我國(guó)有關(guān)番茄頸腐根腐病的研究報(bào)道較少，且多數(shù)集中在病原菌鑒定以及防治措施的簡(jiǎn)單描述方面，在頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選方面的工作相對(duì)落后，抗病育種工作進(jìn)展也較為緩慢。本文綜述了該病害的國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展，以期為我國(guó)番茄頸腐根腐病的抗病育種提供借鑒。

1 番茄頸腐根腐病的發(fā)生情況

番茄頸腐根腐病俗稱“死棵病”，是近年來溫室內(nèi)發(fā)生比較嚴(yán)重的一種真菌性病害。該病害最初于1974 年首次在日本被發(fā)現(xiàn)（Sato &Araki，1974），之后蔓延到世界各地，已對(duì)美國(guó)、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韓國(guó)以及歐洲和非洲等許多國(guó)家和地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成重大損失（Sonoda，1976；Krikun et al.，1982；Brammall，1990；Mcgovern et al.，1998；Kim et al.，2001；Can et al.，2004；Portapuglia et al.，2005；Hibar et al.，2007；Jacobs &Heerden，2012；Sepúlveda-Chavera et al.，2014）。我國(guó)于2007 年首次在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害（耿麗華 等，2012），隨后山東、黑龍江等地設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)發(fā)生該病害，并呈現(xiàn)暴發(fā)趨勢(shì)。目前在山東、遼寧、寧夏、北京、黑龍江、河北、山西、甘肅等很多地區(qū)均有番茄頸腐根腐病發(fā)生的報(bào)道，嚴(yán)重威脅我國(guó)設(shè)施番茄生產(chǎn)（程琳 等，2016；張尚卿 等，2017；李瀟 等，2019）。最近幾年，我國(guó)東北、華北地區(qū)發(fā)病比較嚴(yán)重，尤以山東省壽光地區(qū)病情最為突出。據(jù)報(bào)道，壽光日光溫室番茄發(fā)病率達(dá)80%以上，致死率30%以上，造成番茄嚴(yán)重減產(chǎn)（程琳 等，2016）。

2 番茄頸腐根腐病的發(fā)病癥狀及規(guī)律

番茄頸腐根腐病常發(fā)生于保護(hù)地冬春季番茄生產(chǎn)中，在幼苗期和成株期均可發(fā)生，幼苗期（3～5片葉）染病時(shí)主要癥狀表現(xiàn)為在土壤與植株莖基部接觸部位出現(xiàn)明顯的深褐色病斑，幼苗從病斑處折倒而萎蔫致死；5 葉期以后至開花結(jié)果期發(fā)病則出現(xiàn)莖基部縊縮且呈深褐色，植株直立而萎蔫的癥狀（Menzies et al.，1990；耿麗華 等，2012），萎蔫最早出現(xiàn)在一天溫度最高時(shí)，夜間恢復(fù)。把染病的植株縱向剖面后，可以在根和根莖的皮層看到大量的褐變斑點(diǎn)和腐爛現(xiàn)象。由于對(duì)該病害了解較少，其經(jīng)常被誤認(rèn)為番茄枯萎病。研究表明，番茄頸腐根腐病與枯萎病在3 個(gè)方面有明顯差異：①發(fā)病癥狀不同。頸腐根腐病病原菌主要造成番茄莖基部和根部褐變腐爛，莖部維管束褐變通常在土壤線上方25～30 cm 以內(nèi)，而枯萎病病原菌（f.sp.）為害維管束造成植株萎蔫，莖部維管束的褐變超過土壤線1 m；② 適宜的土壤溫度不同。番茄頸腐根腐病最適發(fā)病土壤溫度為18 ℃左右，而枯萎病為27 ℃左右；③寄主范圍不同。番茄枯萎病病原菌只能侵染番茄，而頸腐根腐病病原菌除了能夠侵染番茄外，還能侵染豆科、葫蘆科、藜科的一些植物（耿麗華 等，2012）。

番茄頸腐根腐病病原菌能夠通過土壤、根、葉片直接接觸傳播，通常病原菌通過傷口或新生根產(chǎn)生的自然孔洞侵染植株。該病害侵染周期較長(zhǎng)，如果定植后感染，病癥一般在開始收獲前才得以表現(xiàn)；如果在育苗期間感染，病癥一般在開花時(shí)表現(xiàn)（劉蕾和王輝，2016）。此外，土壤pH 低、氨態(tài)氮以及土壤積水都能導(dǎo)致頸腐根腐病病情加重（Roberts et al.，2001）。該病原菌產(chǎn)生的小分生孢子以及厚垣孢子在病原菌的生長(zhǎng)和傳播中起到了重要作用。壞死的組織中能夠產(chǎn)生大量的小分生孢子，它們能夠通過空氣流通傳播，易使殺過菌的土壤發(fā)生二次感染（Rekah et al.，1999）；厚垣孢子有更厚的細(xì)胞壁，使其能夠在土壤或者木質(zhì)中存活更長(zhǎng)的時(shí)間。該病原菌在無植物根系的土壤中傳播能力很弱，但能夠通過染病的植株以及土壤、農(nóng)事操作人員和農(nóng)業(yè)機(jī)械等生產(chǎn)設(shè)備攜帶的厚垣孢子進(jìn)行長(zhǎng)距離的傳播（Rekah et al.，2000）。

3 番茄頸腐根腐病的病原菌鑒定

對(duì)病原菌進(jìn)行分離與鑒定是確定病害類型和進(jìn)行病害治理的前提。植物病原菌傳統(tǒng)的鑒定方法通常從植株發(fā)病癥狀、病原菌形態(tài)特征、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定等方面展開。

3.1 病原菌形態(tài)特征

耿麗華等（2012）、李景富等（2018）對(duì)影響番茄頸腐根腐病病原菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該病原菌產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，碳源為葡萄糖，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，致死溫度為63 ℃，最適pH 值為8。該病原菌在PDA 培養(yǎng)基上呈淡紫灰色、白色或粉色，菌落圓形，平鋪生長(zhǎng)，菌絲絨毛狀。25 ℃條件下在PDA 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)5 d，菌落直徑60 mm 左右（耿麗華 等，2012）。病原菌主要產(chǎn)生3 種類型的孢子：大分生孢子、小分生孢子和厚垣孢子。大分生孢子鐮刀形，長(zhǎng)度20～25 μm，以3 個(gè)隔膜為主；小分生孢子長(zhǎng)橢圓形或紡錘形，長(zhǎng)度4～8 μm，通常無隔，是主要傳播形態(tài)；厚垣孢子為透明狀球形，頂生或間生，多為單獨(dú)生長(zhǎng)，偶爾也對(duì)生或串生；分生孢子梗短、生于菌絲側(cè)面，單生，無分枝（耿麗華 等，2012；李景富 等，2018）。

3.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

近幾年隨著分子生物學(xué)發(fā)展，PCR 檢測(cè)技術(shù)在病原菌檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)番茄頸腐根腐病病原菌的rDNA-ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可得到大小約500 bp 的片段，該引物在尖孢鐮刀菌的鑒定中得到廣泛應(yīng)用。但是尖孢鐮刀菌不同專化型在rDNA-ITS 區(qū)段序列上差異性較小，因而該通用引物無法區(qū)分尖孢鐮刀菌種內(nèi)不同專化型及生理小種。Hirano 和Arie（2006）根據(jù)尖孢鐮刀菌中多聚半乳糖醛酸酶基因設(shè)計(jì)特異性引物sprl來區(qū)分番茄頸腐根腐病病原菌Forl、番茄枯萎病病原菌Fol，以及Fol 的3 個(gè)生理小種，利用該引物通過PCR 可在Forl 小種中擴(kuò)增出947 bp 大小的條帶，而其他小種均不能擴(kuò)增產(chǎn)生條帶。

3.3 病原菌致病性測(cè)定

分子生物學(xué)鑒定難以區(qū)分致病與非致病菌株，Carmona 等（2020）在采集組織標(biāo)本分離尖孢鐮刀菌致病菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)非致病尖孢鐮刀菌菌株同時(shí)存在，且存在的比例較高。因此，進(jìn)行病原菌致病性測(cè)定是植物病原菌鑒定中必不可少的環(huán)節(jié)。將從田間病株分離獲得的病原菌于健康植株上進(jìn)行回接，發(fā)病后取寄主病健交界處組織進(jìn)行再分離，根據(jù)回接后寄主發(fā)病癥狀和再分離獲得的病原菌形態(tài)特征來確定病原菌種類。番茄頸腐根腐病病原菌（Forl）的寄主范圍很廣，區(qū)別于只侵染番茄的枯萎病病原菌（Fol），它不僅能夠侵染番茄，還能侵染辣椒、茄子、黃瓜、菜豆等其他作物，這為Forl 與Fol的區(qū)分提供了有力證據(jù)（Rowe，1980；Menzies et al.，1990；耿麗華 等，2012）。

4 番茄頸腐根腐病的抗性鑒定

室內(nèi)苗期人工接種鑒定是種質(zhì)資源抗病性鑒定的重要方法之一，其優(yōu)點(diǎn)在于可以有效控制環(huán)境因子，且保證寄主只被單一病原菌侵染，同時(shí)能夠避免因病原菌蔓延而造成的生產(chǎn)影響，因此得到育種工作者的普遍重視。浸根法是目前進(jìn)行番茄頸腐根腐病接種最常用的方法（Mutlu et al.，2015；Kim et al.，2016；Devran et al.，2018），具體操作過程：將分離純化的病原菌接種到PDA 液體培養(yǎng)基中，置于搖床中以25 ℃、120 r · min振蕩培養(yǎng)3 d，或在PDA 平板上25 ℃暗培養(yǎng)7 d，將菌體刮入無菌水中，過濾除去菌體，配制濃度為1 × 10個(gè) · mL的孢子懸浮液。待番茄幼苗2～3 片真葉完全展開時(shí)，用清水將根系清洗干凈，放在孢子懸浮液中進(jìn)行浸根接種處理15 min，然后移栽至滅菌基質(zhì)中，對(duì)照組用清水浸根15 min，接種后置于18～22 ℃室內(nèi)環(huán)境中，16 h · d光照條件下培養(yǎng)。接種處理3～4 周后，觀察、記錄材料的發(fā)病情況。除浸根法外，研究者還探索了莖基部注射接種法（姜景彬等，2018）、棉球接種法（李景富 等，2018）和灌根法（李瀟 等，2019）。王夢(mèng)蕊等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，采用不同的人工接種方法番茄頸腐根腐病的發(fā)病情況有所不同。浸根法和灌根法相較于注射法效果較好，浸根法操作技術(shù)要求相對(duì)較低，菌液可以多次使用，對(duì)菌液量要求少，適合大規(guī)模的抗性資源篩選；而灌根法是在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，對(duì)植株根系進(jìn)行處理后使其存在傷口而更容易被病原菌侵染，該方法省時(shí)省力，但對(duì)菌液量要求極大，適合對(duì)少量材料進(jìn)行接種鑒定；注射法操作技術(shù)要求較高，且病情指數(shù)不同重復(fù)間偏差較大，推測(cè)可能是因?yàn)樽⑸溥M(jìn)幼苗莖基部的菌液溢出，導(dǎo)致無法定量每個(gè)單株注射的菌液量，從而影響試驗(yàn)結(jié)果，另外不同操作者的接種效果也可能不同，因此該方法并不適合大批量材料的鑒定。

5 番茄抗頸腐根腐病的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

番茄頸腐根腐病侵染周期相對(duì)較長(zhǎng)，目前還沒有十分安全有效的防治方法（Liu et al.，2010），所以對(duì)于該病害最科學(xué)有效的防治方法就是選育抗病品種。已有研究表明，番茄頸腐根腐病抗性來源于野生秘魯番茄（）材料PI126944、PI128650 和PI126926，由顯性單基因控制，該基因已被定位到9 號(hào)染色體上（Vakalounakis，1988；Laterrot &Moretti，1991；Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999），并且被轉(zhuǎn)育到栽培番茄中（Scott &Jones，2000）。日本研究者利用PI126944 將其抗性轉(zhuǎn)育至栽培番茄IRB#301 中（Yamakawa &Nagata，1975），法國(guó)研究者利用PI126926 育成了抗性栽培番茄Moperou（Elkind et al.，1988），而美國(guó)研究者利用IRB#301育成了抗性栽培番茄Fla.7226、Fla.7464、Fla.7775和Fla.7781 等（Scott &Jones，2000）。近年來，國(guó)外先后選育了多個(gè)抗病番茄品種，如以色列海澤拉種子公司的羅拉、圣羅蘭、安納西，美國(guó)圣尼斯種子公司的SV4224TH 等；然而國(guó)內(nèi)在番茄抗頸腐根腐病品種選育方面研究比較緩慢，目前在生產(chǎn)上尚沒有綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的抗病品種（劉蕾和王輝，2016）。程琳等（2016）利用人工接種鑒定病原菌的方法對(duì)25 份番茄種質(zhì)材料進(jìn)行抗病性鑒定，確定了其中對(duì)頸腐根腐病表現(xiàn)抗性的21 份材料，這些材料可用于今后的番茄抗病育種工作中。

國(guó)外研究者在基因的遺傳定位和分子標(biāo)記的開發(fā)方面做了很多工作。Vakalounakis 等（1997）研究認(rèn)為，番茄抗頸腐根腐病基因與抗煙草花葉病毒基因-連鎖，二者遺傳距離為（5.1 ±1.07）cM。隨 后，F(xiàn)azio 等（1999）確定了9 號(hào)染色體上與分子標(biāo)記的遺傳順序?yàn)門G101-UBC655-UBC116-UBC194-，但由于UBC194為RAPD 標(biāo)記，檢測(cè)結(jié)果不易區(qū)分，且與基因距離為5.1 cM，因此其應(yīng)用受到了一定的限制（Tanyola? &Akkale，2010）。Staniaszek 等（2014）將距離基因約3 cM 的C2_At2 g38025 標(biāo)記改造成了CAPS 標(biāo)記C2-25，該標(biāo)記在番茄頸腐根腐病抗病材料的分子輔助選擇中得到了一定的應(yīng)用（程琳 等，2016，2021；劉蕾 等，2018），然而王夢(mèng)蕊等（2022）采用100 份不同背景來源的番茄種質(zhì)材料進(jìn)行驗(yàn)證，該標(biāo)記的吻合率僅為59%，與程琳等（2016）采用25 份材料驗(yàn)證的吻合率100%差距較大，其原因可能在于程琳等（2016）試驗(yàn)中所檢測(cè)的材料均引自荷蘭，其遺傳背景較為單一，因此分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果高度吻合，而王夢(mèng)蕊等（2022）所用試驗(yàn)材料為收集保存的自然群體及不同來源的新品種，遺傳背景較為復(fù)雜，因此該標(biāo)記準(zhǔn)確率較低。Mutlu 等（2015）利用只攜帶基因，而不含-基因的材料Fla.7781構(gòu)建群體，篩選獲得了1 個(gè)SCAR 標(biāo)記SCAR，該標(biāo)記距離基因僅0.016 cM，位于9 號(hào)染色體的61.78 Mb 位置，與標(biāo)記C2-25 的物理位置（5.49 Mb）較遠(yuǎn)，然而在43 份商品種番茄材料中驗(yàn)證其準(zhǔn)確率不到45%（Kim et al.，2016）。在王夢(mèng)蕊等（2022）的驗(yàn)證試驗(yàn)中，該標(biāo)記的準(zhǔn)確率也僅有51%，表明該標(biāo)記不適用于抗頸腐根腐病的輔助選擇育種。Kim 等（2016）篩選了2 個(gè)與連鎖的分子標(biāo)記PNU-T1212（5.1 Mb）和PNU-D4（6.1 Mb），在F群體中的準(zhǔn)確率分別為93.2%和92.8%，但在60 份商品種番茄材料中的準(zhǔn)確率約為60%和90%。在王夢(mèng)蕊等（2022）的驗(yàn)證試驗(yàn)中，標(biāo)記PNU-D4 的準(zhǔn)確率為83%。Devran 等（2018）通過基因組重測(cè)序和生物信息學(xué)分析將基因定位在9 號(hào)染色體4.2～5.1 Mb 范圍內(nèi)，并分析了定位區(qū)間內(nèi)的注釋基因，但該研究并沒有預(yù)測(cè)或驗(yàn)證候選基因功能。到目前為止，對(duì)于基因的定位和分子標(biāo)記的應(yīng)用，不同研究者的試驗(yàn)結(jié)果并不一致，因此還需進(jìn)一步加強(qiáng)基因的定位克隆和分子標(biāo)記開發(fā)研究工作。

6 展望

番茄頸腐根腐病病原菌與番茄枯萎病病原菌相比，雖然同為尖孢鐮刀菌，但其寄主范圍更廣，危害范圍更大。對(duì)此，番茄生產(chǎn)者應(yīng)給予高度重視，特別是要注意合理安排不同作物的換茬輪作。近年來，我國(guó)設(shè)施番茄栽培面積逐年增大且往往連續(xù)種植，該病一旦流行將會(huì)給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)頸腐根腐病在番茄主栽區(qū)的發(fā)生、發(fā)展情況，為該病害的發(fā)生做好預(yù)防和控制工作。

目前，我國(guó)在番茄抗頸腐根腐病方面的研究相對(duì)薄弱，主要集中在病原菌鑒定和病害防治方面，在遺傳學(xué)研究方面基本處于空白，因此極大地阻礙了番茄抗頸腐根腐病的育種進(jìn)程。另有研究表明，較早應(yīng)用到抗病育種中的秘魯番茄PI128650同時(shí)攜帶有抗病基因-和，對(duì)348 份栽培番茄材料基因組重測(cè)序顯示，其中20 份材料攜帶有秘魯番茄9 號(hào)染色體上長(zhǎng)約50 Mb 的片段，該外源野生片段占據(jù)了9 號(hào)染色體的大部分區(qū)域（Lin et al.，2014）。由于野生番茄和栽培種番茄存在結(jié)構(gòu)變異（Seah et al.，2004；Ji et al.，2007），在長(zhǎng)期的自交和回交選育過程中，該外源片段依舊沒有完全被打斷，這種情況可能會(huì)導(dǎo)致在番茄抗煙草花葉病毒病和頸腐根腐病育種中產(chǎn)生很多不良性狀，比如某些攜帶-抗性基因的番茄材料會(huì)表現(xiàn)為植株長(zhǎng)勢(shì)較弱，葉片發(fā)黃等（崔麗朋 等，2017）?？剐曰蜻B鎖累贅是培育優(yōu)質(zhì)多抗番茄品種的主要障礙，這可能是目前生產(chǎn)上沒有綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的抗頸腐根腐病番茄品種的重要原因之一。如何通過全基因組分子設(shè)計(jì)育種和利用分子標(biāo)記輔助選擇打破抗病基因連鎖累贅，是現(xiàn)今培育優(yōu)質(zhì)多抗番茄品種的重點(diǎn)和難點(diǎn)，研究者應(yīng)加強(qiáng)抗病基因的定位和克隆等工作，為番茄抗病新品種的培育奠定基礎(chǔ)。