體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及機(jī)制

劉之川 簡(jiǎn)華剛 王麗華 梅 英

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷燒傷科，重慶 400010)

本實(shí)驗(yàn)著重研究人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVECs)在人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)體外聯(lián)合培養(yǎng)中，對(duì)于hBMSCS的生長(zhǎng)、形態(tài)以及細(xì)胞分化所產(chǎn)生的影響，并且對(duì)hUVECs在聯(lián)合培養(yǎng)體系中對(duì)hBMSCs的Runx2與Bmi-1基因表達(dá)的作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(UVECs)的培養(yǎng) 將hBMSCs進(jìn)行分離，并將其培養(yǎng)至第3代，然后在顯微鏡下倒置觀察其細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。選擇ATCC人臍靜脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞系來(lái)作為hUVECs的來(lái)源，并在低血清培養(yǎng)基當(dāng)中，放置在37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，將其培養(yǎng)至第3代，并對(duì)各細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.2建立聯(lián)合培養(yǎng)裝置 選用培養(yǎng)至第3代的人hBMSCs和hUVECs，準(zhǔn)備6孔板，將6孔板置入插入式的培養(yǎng)皿當(dāng)中，建立培養(yǎng)液和使細(xì)胞因子能夠互相通連的聯(lián)合培養(yǎng)裝置，設(shè)單獨(dú)hBMSCs組、單獨(dú)hUVECs組及hUVECs組與hBMSCs1∶1聯(lián)合培養(yǎng)，分別將其編號(hào)為1、2、3。在每孔中置入含有10%胎牛血清的L-DMEM液2 ml，并于隔日對(duì)液體進(jìn)行置換，將樣本放置于37℃，5%CO2飽和的濕度培養(yǎng)箱當(dāng)中進(jìn)行培養(yǎng)。分別在第4、6、8、10天在顯微鏡下對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)的變化進(jìn)行倒置觀察。

1.3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 分別在進(jìn)行培養(yǎng)后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天各取每組1孔，用胰酶進(jìn)行消化之后對(duì)1套聯(lián)合培養(yǎng)裝置中hBMSCs計(jì)數(shù)，并描繪出hBMSCs的生長(zhǎng)曲線。

1.4對(duì)Bmi-1、Runx2基因的定量檢測(cè) 分別在第4、6、8、10天對(duì)1.2中的各組6孔板各取6孔，采用熒光定量PCR(FQ-PCR)的方法，對(duì)各組中的Bmi-1、Runx2基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。具體的檢測(cè)步驟操作如下。

1.4.1標(biāo)本的收集 將Trizol試劑在6孔培養(yǎng)板當(dāng)中的每孔中加入1 ml，然后對(duì)細(xì)胞使用移液槍進(jìn)行反復(fù)的吹打之后裝入1.5 ml的離心管中，保持在-80℃的冰箱當(dāng)中。

1.4.2總RNA提取 ①在每毫升的Trizol當(dāng)中加入0.2 ml的氯仿，vortex以15 s進(jìn)行混勻或是晃動(dòng)，在室溫下放置2 min到3 min；②進(jìn)行15 min的12 000 r/min 4℃離心，然后將含總RNA的上層水相吸取至一個(gè)新的離心管當(dāng)中，每毫升的Trizol大約可以吸取到0.5～0.55 ml；③按照最初的每毫升的Trizol當(dāng)中加入0.5 ml的異丙醇，并進(jìn)行數(shù)次的顛倒以混勻，再在室溫下進(jìn)行10 min的沉淀；④在進(jìn)行10 min的12 000 r/min 4℃離心，可在管底見(jiàn)RNA的沉淀，將上清棄掉；⑤將1 ml的75%乙醇加入每毫升最初的Trizol當(dāng)中，vortex或是進(jìn)行顛倒以將液體混勻，在進(jìn)行5 min的7 500 r/min 4℃離心，將上清棄掉。再使用離心機(jī)將其輕甩一下，并將液體小心的吸盡；⑥待到RNA略微干了之后，加入20 L DEPC水溶解，并在-70℃條件下進(jìn)行凍存。值得注意的是，要避免RNA過(guò)分的干燥，否則會(huì)不利于進(jìn)行溶解，同時(shí)測(cè)出的A260/280的值也會(huì)比1.6低。

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄 分別從兩組的細(xì)胞當(dāng)中對(duì)總RNA進(jìn)行提取，并將其合成為cDNA。嚴(yán)格按照用逆轉(zhuǎn)錄試劑的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作。

1.4.4引物設(shè)計(jì) β-actin、 Runx2、Bmi-1基因的引物以及PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的長(zhǎng)度的具體數(shù)據(jù)如下表1中所示。

表1 Bmi-1、Runx2、β-actin引物

1.4.5對(duì)樣本的cDNA純度與濃度的檢測(cè) 對(duì)各樣本的純度與濃度采用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.6對(duì)引物及模板的驗(yàn)證 在每次進(jìn)行操作之后，對(duì)樣本進(jìn)行隨機(jī)的抽取，選取5～8例，對(duì)樣本采用電泳分析法，以檢測(cè)看家基因-actin、Bmi-1、Runx2的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。

1.4.7PCR擴(kuò)增 對(duì)所有的單管樣本全部復(fù)設(shè)3孔。并根據(jù)具體的擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)溶解曲線進(jìn)行分析，以對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察 當(dāng)?shù)?代的hBMSCs與HUVECs進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)到第4天時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)出多樣化的變化，出現(xiàn)梭形與多角形的混合生長(zhǎng)，梭形多如圖1所示；培養(yǎng)到第6天時(shí)細(xì)胞的體積如圖1中所示表現(xiàn)有明顯的增大；培養(yǎng)到第8天的時(shí)候有部分細(xì)胞如圖1中所示開(kāi)始出現(xiàn)連接的現(xiàn)象；培養(yǎng)到第10天的時(shí)候細(xì)胞如圖1中所示失去了接觸抑制進(jìn)而形成了細(xì)胞的團(tuán)塊。

2.2兩組中hMSCs生長(zhǎng)曲線 hMSCs組與聯(lián)合培養(yǎng)組相比其數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3對(duì)堿性磷酸酶(ALP)的定量檢測(cè) 各組檢測(cè)的ALP的量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增高而后逐漸減低的趨勢(shì)，在第8天聯(lián)合培養(yǎng)組的ALP量達(dá)到最高；而hBMSCs組與單獨(dú)hUVECs組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所檢測(cè)到的ALP的量并沒(méi)有明顯的變化，見(jiàn)表3。

2.4熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果 聯(lián)合組Bmi-1檢測(cè)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增高后降低，第8天時(shí)聯(lián)合培養(yǎng)組Bmi-1最高；聯(lián)合組與單獨(dú)hMSCs組在各時(shí)間點(diǎn)差異較明顯；單獨(dú)hMSCs組Bmi-1在各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有明顯變化。

第4天

第6天

第8天

第10天

組別時(shí)間(d)1 2 3 4 5時(shí)間(d)6 7 8 9 10聯(lián)合培養(yǎng)組3.0±0.133.4±0.345.7±0.097.7±0.1916.9±0.1520.6±0.2123.7±0.2224.6±0.4125.4±0.2425.1±0.11單獨(dú)hMSCs組3.1±0.223.4±0.254.0±0.205.5± 0.2612.1±0.17117.0±0.3220.0±0.1522.9±0.3024.4±0.2124.3±0.22

表3 各細(xì)胞培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)ALP含量(n=6，±s)

表4 各細(xì)胞培養(yǎng)組各個(gè)時(shí)間的Bmi-1含量(n=6，±s)

聯(lián)合組Runx2檢測(cè)量隨時(shí)間延長(zhǎng)先增高后降低，第8天時(shí)聯(lián)合培養(yǎng)組Runx2最高；聯(lián)合組與單獨(dú)hMSCs組在各時(shí)間點(diǎn)差異較明顯；單獨(dú)hMSCs組Runx2在各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)表5。

表5 各細(xì)胞培養(yǎng)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Runx2含量(n=6，±s)

3 討 論

在體內(nèi)由于hBMSCs所定居的位置的不同，同時(shí)又由于在微環(huán)境當(dāng)中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等起調(diào)控作用物質(zhì)的不同，可以使hBMSCs向不同的譜系進(jìn)行分化，并且可以跨胚層進(jìn)行分化。研究hBMSCs細(xì)胞周期表明，有大約20%的hBMSCs是處于G0期，表明hBMSCs是具有著十分強(qiáng)大的增殖能力與分化能力〔1〕。經(jīng)研究表明，hBMSCs在進(jìn)行了12代的體外培養(yǎng)之后仍然能夠保持著正常的端粒酶活性以及染色體表型，在經(jīng)過(guò)15代的培養(yǎng)之后仍然能夠保持其自身的成骨分化的潛能。在對(duì)hBMSCs進(jìn)行深入研究之后表明，在動(dòng)物體內(nèi)的骨祖細(xì)胞存在2種類型：一是僅僅在骨髓中存在的，不需要誘導(dǎo)物就可以自動(dòng)進(jìn)行分化的成骨干細(xì)胞，因此而被稱為定向性成骨母細(xì)胞，定向性成骨母細(xì)胞的特點(diǎn)是處于胚胎期的間充質(zhì)祖細(xì)胞存留在骨內(nèi)；其二是必須由外源性的誘導(dǎo)物對(duì)其發(fā)生作用才可以被誘導(dǎo)分化成為成骨間充質(zhì)干細(xì)胞，因此稱為誘導(dǎo)型成骨母細(xì)胞〔2〕。誘導(dǎo)型成骨母細(xì)胞不能夠自發(fā)形成骨組織，它必須在外源性的誘導(dǎo)物持續(xù)的作用之下才能夠定向的分化成為骨組織。hBMSCs分化成為成骨細(xì)胞中的定向誘導(dǎo)既能夠通過(guò)化學(xué)藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)，同時(shí)也可以通過(guò)細(xì)胞因子或是生長(zhǎng)因子的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)〔3〕。

多梳基因家族在果蠅發(fā)育是發(fā)揮使同源異形基因維持穩(wěn)定表現(xiàn)的重要因子〔4〕。Bmi-1基因中有一個(gè)環(huán)指模序，它主要存在于N-末端環(huán)指結(jié)構(gòu)域之中，同抑癌基因C-Myc在腫瘤形成和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著協(xié)同的作用〔5〕。Bmi-1基因通過(guò)其環(huán)指結(jié)構(gòu)同其他的環(huán)指蛋白相互結(jié)合，例如dinG等所形成的異源二聚體，進(jìn)而對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制的作用。在Bmi-1基因中心還存在著一個(gè)保守DNA結(jié)合模序，螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(H-T-H-T)，也發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄抑制的作用〔6〕。本研究結(jié)果提示Bmi-1基因兩個(gè)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞生存期的延長(zhǎng)和抑制p16上都發(fā)揮著不可或缺的作用，若將這兩個(gè)結(jié)構(gòu)敲除，那么Bmi-1基因?qū)?huì)失去其活性，進(jìn)而導(dǎo)致早衰的現(xiàn)象出現(xiàn)〔7〕。在多細(xì)胞生物整個(gè)生命周期中，干細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生分化細(xì)胞的類型，進(jìn)而對(duì)生物體最終的壽命起決定作用。經(jīng)研究表明，經(jīng)過(guò)純化的鼠與人造血干細(xì)胞同樣對(duì)Bmi-1的表達(dá)都具有十分高的水平〔8〕。Qiao等〔9〕在從臍帶中分離出的間質(zhì)干細(xì)胞上同樣也發(fā)現(xiàn)了Bmi-1的表達(dá)。通過(guò)Bmi-1對(duì)能夠決定干細(xì)胞命運(yùn)的基因如干細(xì)胞、抗增殖基因以及生存基因等相關(guān)基因發(fā)揮控制作用從而對(duì)HSC的自我更新發(fā)揮調(diào)節(jié)的作用。

Runx2屬于轉(zhuǎn)錄因子RUNXX家族中的成員之一，它作為成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于骨組織的形成以及重建發(fā)揮著十分重要的作用。Runx2具有3種類型的異構(gòu)體〔10〕，它們分別具有不同的N-端序列。這3種類型分別是以MRIPVD作為起始的氨基酸序列的Ⅰ型，和以MASNSL作為起始的氨基酸序列的Ⅱ型以及以MLHSPH作為起始的氨基酸序列的Ⅲ型。Runx2對(duì)多能干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞起著決定性的作用，Komori等〔11〕采取將目的基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)，由于在敲除之后不能有效的分化成為成骨細(xì)胞，使得具有RUNX2缺陷的小鼠膜內(nèi)軟骨和內(nèi)骨不能分化成骨，由此證實(shí)了RUNX2在成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中是所一個(gè)必不可少的因子。RUNx2的表達(dá)比軟骨細(xì)胞分化成為肥大軟骨細(xì)胞要早〔12〕，由此說(shuō)明了RUNXX蛋白能夠在軟骨形成的早期階段參與。

體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中，hBMSCs同hUVECs具有良好的相容性，且hUVECs能夠?qū)BMSCs的增殖起到促進(jìn)的作用。

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