自噬對三氧化二砷所致正常淋巴細胞損傷的保護效應

李彩麗 魏虎來 陳 靜 黃雙盛 李永泉 田寶瑩

(西北民族大學醫(yī)學院生物化學教研室，甘肅 蘭州 730030)

自噬是指當個體細胞遇到生存壓力(如營養(yǎng)缺乏、環(huán)境刺激、藥物等)時，細胞通過雙層膜將受損、變性、衰老和失去功能的細胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子以及入侵的物質(zhì)包裹形成直徑約400～900 nm大小的自噬小體，接著自噬小泡的外膜與溶酶體膜融合，并最終在一系列水解酶的作用下將其降解，從而為細胞的重建、再生和修復提供必需原料，實現(xiàn)細胞的再循環(huán)和再利用，以保全其他細胞的一種自我保護機制〔1〕。因此，自噬可作為一種防御機制來抵御環(huán)境變化對細胞造成的損傷。三氧化二砷(As2O3)在治療急性早幼粒細胞白血病方面有良好的殺傷效應及特異的作用機制。近年來，As2O3在基礎研究及臨床應用方面均顯示其具有較廣譜的抗腫瘤效應。然而，As2O3在抑制腫瘤生長的同時，還對人體具有免疫抑制和免疫毒性作用〔2，3〕,但其作用機制尚不清楚。本研究通過觀察自噬與凋亡在As2O3抑制淋巴細胞(PBL)增殖過程中的作用,探討As2O3的免疫毒性作用及其機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 As2O3為Sigma公司產(chǎn)品，配成10 mmol/L貯備液；3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自Sigma公司，用PBS配成100 mmol/L的貯備液；單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染料用PBS 配成1.5 mmol/L的貯備液；Annexin-V/PI雙標記染色試劑盒購自上海凱基公司；蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物公司；兔抗人Beclin-1一抗和鼠抗兔二抗均為Cell Signaling 公司產(chǎn)品； MTT和RPMI 1640均為Sigma公司產(chǎn)品；無噬菌體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；淋巴細胞分離液(武漢博士德生物公司)。

1.2方法

1.2.1PBL分離與培養(yǎng) 抽取健康人靜脈血10 ml,肝素鈉抗凝，用RPMI1640或PBS以等體積稀釋，將稀釋后的血液沿管壁緩慢加到含等量淋巴細胞分離液的液面上，室溫離心2 000 r/min，20 min，吸取中間界面層單個核細胞。用RPMI1640洗2次，每次1 500 r/min，10 min，用1%的臺盼藍染色計數(shù)。細胞按5×105/ml接種于含15%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖活性檢測 調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，接種96孔板，分組，每組設6個復孔，分別加入1，2，4，8 μmol/LAs2O3，其中抑制自噬組用4 mmol/L 3-MA預先處理細胞2 h后再加入As2O3處理細胞，培養(yǎng)不同時間后，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加10%SDS過夜，以570 nm為測試波長，讀取吸光度A 值，計算細胞生長抑制率。

1.2.3Annexin-V/PI雙標記染色檢測凋亡 按文獻〔4〕收集細胞,PBS洗滌。用500 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,避光室溫放置10 min，流式細胞儀檢測凋亡。

1.2.4MDC熒光染色檢測細胞自噬 按文獻〔5〕的方法收集細胞，PBS洗2次除去含血清的培養(yǎng)基，用0.05 mmol/L MDC于37℃避光孵育1 h后，PBS洗2次，用涂片離心機涂片后熒光顯微鏡觀察和攝片。

1.2.5電鏡觀察細胞自噬和凋亡超微結(jié)構(gòu) 按文獻〔6〕的方法收集細胞，以2 000 r/min離心15～20 min,棄上清，4℃預冷的PBS洗3次。沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液，在4℃環(huán)境中靜置30～60 min，冷PBS洗3次，1%四氧化鋨4℃再固定15～30 min，梯度丙酮溶液逐級脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察細胞凋亡及自噬的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6Bcl-2蛋白表達水平測定 收集細胞，PBS洗滌。分別加入細胞固定劑和通透劑，再加入FITC標記的鼠抗人Bcl-2單抗染色，F(xiàn)ITC標記的鼠IgG1同型抗體為對照，F(xiàn)CM檢測Bcl-2蛋白表達陽性率和平均熒光強度。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行T檢驗。

2 結(jié) 果

2.1As2O3對正常淋巴細胞的損傷作用 1.0～8.0 μmol/L As2O3對正常人PBL均有抑制作用，并呈濃度與時間依賴關系，As2O3作用24 h、48 h的IC50分別為12、46、3.76 μmol/L，見表1。

2.2As2O3誘導正常淋巴細胞發(fā)生自噬 MDC是一種熒光染料，能選擇性與自噬泡結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光。用5 μmol/L As2O3作用正常PBL 48 h后，用MDC染色，熒光顯微鏡觀察到細胞內(nèi)有大量點塊狀熒光結(jié)構(gòu)，較正常對照組明顯增強，和透射電鏡結(jié)果一致。見圖1。

圖1 As2O3誘導的PBL自噬改變

2.33-MA抑制自噬促進As2O3對淋巴細胞的損傷效應 3-MA是自噬的特異性抑制劑。通過3-MA抑制As2O3誘導的自噬后，PBL細胞存活率較抑制前明顯下降，24 h、48 h的IC50分別由抑制前的12.46 μmol/L和3.76 μmol/L下降為抑制后的10.40 μmol/L和2.31 μmol/L。見表1。

2.43-MA抑制自噬增強As2O3誘導的PBL凋亡 5 μmol/L As2O3作用48 h可誘導PBL細胞發(fā)生凋亡，細胞凋亡率為41.4%；電鏡下細胞出現(xiàn)胞體變形、核固縮、常異染色質(zhì)分離呈新月形等凋亡改變，同時胞質(zhì)內(nèi)有自噬體形成，MDC染色胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)多量點塊狀綠色熒光。用3-MA抑制自噬后，發(fā)現(xiàn)5 μmol/L As2O3誘導的凋亡細胞較抑制前明顯增多，凋亡率增至60.3%；細胞凋亡形態(tài)特征較自噬抑制前更加顯著，但細胞內(nèi)自噬體則明顯減少。實驗結(jié)果說明As2O3可誘導PBL發(fā)生自噬性死亡，抑制自噬可促進As2O3誘導的細胞凋亡。見圖2。

2.53-MA抑制自噬對細胞Bcl-2表達的影響 Bcl-2 是一種細胞凋亡抑制因子，具有抑制細胞凋亡的功能。5 μmol/L As2O3處理48 h后，PBL細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達陽性率(29.3%)和平均熒光強度(MFI=1.77)較對照(49.0%，1.91)降低。用3-MA抑制自噬后再用5 μmol/L As2O3處理細胞，Bcl-2蛋白表達水平較抑制自噬前進一步下降(17.9%，1.43)，提示3-MA有可能通過進下調(diào)Bcl-2基因的表達而增加As2O3對PBL的損傷效應。

表1 3-MA抑制自噬促進As2O3誘導的PBL損傷±s，n=6)

圖2 3-MA對As2O3誘導的PBL自噬與凋亡形態(tài)改變的影響

3 討 論

自噬是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制,同時自噬還參與多種疾病的病理過程〔7〕。研究發(fā)現(xiàn),當細胞受到化療藥物等刺激時,可觀察到細胞的自噬功能增強〔8〕，此時，細胞通過啟動自噬來清除受損線粒體,可保護細胞免于凋亡和壞死的危險,但當自噬能力不足時,線粒體凋亡因子將激活凋亡途徑。

淋巴細胞是免疫調(diào)控的主要群體，其活化/死亡對人體免疫功能有重要的影響。As2O3是目前臨床上廣泛使用的較廣譜的抗腫瘤藥物，大量研究表明，As2O3的抗腫瘤效應主要通過誘導腫瘤細胞凋亡〔9〕，近年來的研究還顯示As2O3在誘導細胞凋亡的同時還可能誘導細胞發(fā)生自噬〔10〕。盡管對腫瘤細胞有較強和較特異的殺傷效應，但也同時對正常淋巴細胞具有一定的損傷作用，導致機體免疫抑制或免疫毒性作用〔2，3〕，As2O3損傷淋巴細胞的具體機制尚不清楚。本文研究證實As2O3對正常外周血淋巴細胞具有較強的細胞毒效應，抑制淋巴細胞增殖和誘導凋亡；同時發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導淋巴細胞產(chǎn)生明顯的自噬反應。若采用3-MA抑制細胞自噬，As2O3對淋巴細胞的增殖抑制和凋亡誘導效應進一步增強，Bcl-2的表達水平降低。提示細胞自噬活性是一種保護機制,可抑制As2O3對外周血淋巴細胞造成的損傷。

綜上所述，As2O3對正常淋巴細胞具有細胞毒效應，誘導淋巴細胞發(fā)生凋亡而損傷正常淋巴細胞，細胞自噬活化可抑制As2O3對淋巴細胞的損傷作用，有利于抵御As2O3對機體的免疫毒性效應。

4 參考文獻

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