食管鱗癌組織β-catenin表達(dá)與淋巴管生成的關(guān)系

李秀娟 李明霞 劉軍超 金春亭 范 婕 李玉珍

(河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

食管癌是死亡率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，淋巴道轉(zhuǎn)移是食管癌患者預(yù)后不良和死亡率較高的重要原因。研究表明腫瘤淋巴管生成對(duì)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移起至關(guān)重要的作用〔1～4〕，而且已有研究證實(shí)食管癌組織中存在著豐富的新生淋巴管〔5〕。β-catenin(β-連環(huán)蛋白)是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵成員，它在腫瘤細(xì)胞質(zhì)(核)的異位表達(dá)在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但其與淋巴管生成是否有關(guān)尚不清楚。Podoplanin即腎小球上皮細(xì)胞整合膜蛋白，是特異性淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物，鼠抗人D2-40單克隆抗體能夠識(shí)別淋巴管內(nèi)皮上的Podoplanin。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)β-catenin和Podoplanin在食管鱗癌組織的表達(dá)，分析β-catenin和Podoplanin與食管癌淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討尋找新型靶向治療腫瘤的方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2010年6月至2012年6月切除的食管癌存檔標(biāo)本蠟塊68例。全部病例術(shù)前未經(jīng)任何治療，經(jīng)手術(shù)后病理切片證實(shí)均為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中男45例，女23例，年齡37～82〔平均(60.25±7.32)〕歲，中位年齡56歲。高分化鱗癌11例，中分化鱗癌16例，低分化鱗癌41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；外膜浸潤(rùn)39例，無(wú)外膜浸潤(rùn)29例。并從中選取20例距腫瘤邊緣>5 cm的正常食管組織作為對(duì)照。

1.2試劑 鼠抗人β-catenin單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體，免疫組化試劑盒和DAB顯色系統(tǒng)均為福州邁新生物制品有限公司產(chǎn)品。

1.3方法 免疫組化SP二步法進(jìn)行染色，石蠟包埋標(biāo)本2 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)3%過(guò)氧化氫37℃ 5 min，β-catenin于檸檬酸緩沖液，Podoplanin于EDTA緩沖液加熱抗原修復(fù)15 min，滴加一抗，37℃60 min，清洗后滴加二抗，37℃30 min，DAB顯色，中性樹(shù)膠封片。染色過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒規(guī)定程序進(jìn)行。同時(shí)用PBS代替一抗作染色的陰性對(duì)照，已知β-catenin、Podoplanin染色陽(yáng)性的胃癌組織片做二者的陽(yáng)性對(duì)照。β-catenin以細(xì)胞膜、胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性信號(hào)，陽(yáng)性信號(hào)集中在細(xì)胞膜的細(xì)胞>50%為膜表達(dá)；陽(yáng)性信號(hào)集中在細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞>50%為漿表達(dá)；陽(yáng)性信號(hào)集中在細(xì)胞核的細(xì)胞>0為核定位。Podoplanin表達(dá)于毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，毛細(xì)淋巴管管壁較薄且不規(guī)則，單層內(nèi)皮細(xì)胞核大且向腔內(nèi)突出，腔內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞。Podoplanin表達(dá)陽(yáng)性者淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色，用淋巴管密度(LVD)表示。先在低倍(10×)視野下選取腫瘤或正常組織中淋巴管最豐富的區(qū)域，再在高倍(40×)視野下計(jì)數(shù)Podoplanin染色陽(yáng)性的淋巴管數(shù)，每例讀數(shù)3個(gè)視野，并求其平均值作為L(zhǎng)VD。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌及正常食管組織中β-catenin的表達(dá) 在20例正常食管組織中β-catenin均表達(dá)于細(xì)胞膜。食管鱗癌組織中β-catenin表達(dá)于胞質(zhì)，并可見(jiàn)部分細(xì)胞中的核定位，細(xì)胞膜上的表達(dá)量相應(yīng)減少，和正常食管組織的表達(dá)相比，癌組織中β-catenin出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的異位表達(dá)(56/68，82.4%)。

2.2食管鱗癌及正常食管組織中Podoplanin的表達(dá) 68例食管癌組織中LVD為(5.71±2.00)，20例正常食管組織的LVD為(4.30±1.32)，食管鱗癌組織中的LVD明顯高于正常組織(P=0.002，t=2.946)。

2.3食管鱗癌β-catenin的異位表達(dá)和LVD與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核β-catenin的異位表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(40/43，93.0%)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(16/25，64.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.275，P=0.007)；在外膜浸潤(rùn)組(36/39，92.3%)明顯高于無(wú)外膜浸潤(rùn)組(20/29，69.0%)(χ2=6.236，P=0.013)，而與年齡、性別、分化程度無(wú)關(guān)。LVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組分別為(6.74±1.75)和(3.93±0.83)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(t=7.521，P=0.001)，而與年齡、性別、分化程度及外膜浸潤(rùn)無(wú)關(guān)。

2.4食管鱗癌β-catenin的異位表達(dá)與LVD的相關(guān)性 β-catenin異位表達(dá)的56例食管癌組織中LVD為(6.02±2.01)，β-catenin僅表達(dá)于細(xì)胞膜的12例食管癌組織中LVD為(4.25±1.19)，二者比較差異顯著(t=2.926，P=0.008)。

3 討 論

β-catenin是一種重要的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架成分，其在維持正常上皮的極性和完整性中發(fā)揮重要作用。正常細(xì)胞中β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)中少見(jiàn)表達(dá)。而在多種腫瘤組織中〔6～10〕，β-catenin出現(xiàn)了異位表達(dá)，即細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的累積和細(xì)胞膜表達(dá)的減少。造成這種改變的原因主要是β-catenin基因突變，降解障礙，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常積聚后與Tcf-4(T細(xì)胞因子-4)結(jié)合，然后穿梭入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游靶基因，從而引起腫瘤細(xì)胞的增殖。新近研究發(fā)現(xiàn)β-catenin信號(hào)通路還可通過(guò)調(diào)控VEGF發(fā)揮對(duì)血管生成的作用〔11〕，但其與淋巴管生成的關(guān)系國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)報(bào)道。

Podoplanin是一種新的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而不表達(dá)于血管內(nèi)皮。用鼠抗人D2-40單克隆抗體特異性識(shí)別Podoplanin，對(duì)腫瘤組織中淋巴管計(jì)數(shù)即LVD，有利于研究腫瘤淋巴管生成的分子機(jī)制。腫瘤組織中Podoplanin高表達(dá)提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良〔12〕。

本研究證實(shí)了食管鱗癌組織中存在β-catenin蛋白的異位表達(dá)，β-catenin可能參與了食管癌的淋巴管生成，促進(jìn)了食管癌的淋巴道轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果為進(jìn)一步解釋腫瘤淋巴管生成機(jī)制和尋找新型抗腫瘤淋巴管生成治療的方法提供了重要的理論依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Du B，Yang ZY，Zhong XY，etal.Metastasis-associated protein 1 induces VEGF-C and facilitates lymphangiogenesis in colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2011;17(9)：1219-26.

2Ozmen F，Ozmen MM，Ozdemir E，etal.Relationship between LYVE-1，VEGFR-3 and CD44 gene expressions and lymphatic metastasis in gastric cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2011;17(27)：3220-8.

3Min Y，Ghose S，Boelte K，etal.C/EBP-δ regulates VEGF-C autocrine signaling in lymphangiogenesis and metastasis of lung cancer through HIF-1α〔J〕.Oncogene.2011;30(49)：4901-9.

4Ozardili I，Guldur ME，Ciftci H，etal.Correlation between lymphangiogenesis and clinicopathological parameters in renal cell carcinoma〔J〕.Singapore Med J.2012;53(5)：332-5.

5李秀娟，劉軍超，張林西，等.VEGF-C和Podoplanin在食管癌中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2011；31(23)：4555-6.

6Guan CN，Chen XM，Lou HQ，etal.Clinical significance of axin and β-catenin protein expression in primary hepatocellular carcinomas〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2012;13(2)：677-81.

7Zhang N，Wei P，Gong A，etal.FoxM1 promotes β-catenin nuclear localization and controls Wnt target-gene expression and glioma tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell,2011；20(4)：427-42.

9Dakeng S，Duangmano S，Jiratchariyakul W，etal.Inhibition of Wnt signaling by cucurbitacin B in breast cancer cells：reduction of Wnt-associated proteins and reduced translocation of galectin-3-mediated β-catenin to the nucleus〔J〕.J Cell Biochem,2012;113(1)：49-60.

10張 勇，王業(yè)林，王恩華.Frat1與β-catenin在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2012;32(11)：2221-2.

11Dilek FH，Topak N，Tokyol C，etal.β-Catenin and its relation to VEGF and cyclin D1 expression in pT3 rectosigmoid cancers〔J〕.Turk J Gastroenterol,2010;21(4)：365-71.

12Wu HM，Ren GX，Wang LZ，etal.Expression of podoplanin in salivary gland adenoid cystic carcinoma and its association with distant metastasis and clinical outcomes〔J〕.Mol Med Report,2012;6(2)：271-4.