豚鼠鐮刀菌性角膜炎模型的建立

賀 丹 高 嵩 萬 雪 宗方偉 張 琳 王 麗

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系 吉林大學(xué)真菌研究中心，吉林 長春 130021)

真菌性角膜炎可引起失明或者失去患眼，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量〔1～5〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國超過60%的嚴重感染性角膜炎是由真菌引起的〔6,7〕。病原菌以鐮刀菌屬最多，其中茄病鐮刀菌的感染率最高〔7～9〕。角膜外傷、特別是植物性外傷是引起該病最常見的特異性易感因素，超過50%的感染與患者曾發(fā)生角膜外傷有關(guān)〔3,9,10〕，且中老年(41～60歲)、男性、農(nóng)民易發(fā)生真菌性角膜炎〔7,9,11〕。吉林省是我國糧食和經(jīng)濟作物主要產(chǎn)區(qū)，從事農(nóng)業(yè)勞作人數(shù)較多，耕作條件相對落后，受植物性外傷的機會較多，導(dǎo)致真菌性角膜炎，特別是鐮刀菌性角膜炎的發(fā)病率較高〔9,11〕。由于鐮刀菌引起的角膜潰瘍癥狀重，破壞性強，如不及時診斷、有效治療，?？蓪?dǎo)致角膜穿孔或失明。因此，建立良好的實驗動物模型對于研究真菌性角膜炎的發(fā)病機制、建立快速鑒定診斷方法及開發(fā)新型抗真菌藥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1實驗菌株 茄病鐮刀菌(JLCC 30886)分離自吉林省真菌性角膜炎患者角膜刮片標本，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，保藏于吉林大學(xué)真菌研究中心。將該菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d。用1.5 ml含0.1%吐溫80的無菌生理鹽水沖洗斜面，制備孢子懸液。在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度為1.0×106CFU/ml和1.0×107CFU/ml。

1.2實驗動物 清潔級、健康成年雄性豚鼠60只，平均體重425 g，眼部狀況良好，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供和飼養(yǎng)。

1.3主要實驗用品 滅菌鼠糧和墊料(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，苦味酸和水合氯醛(北京鼎國公司)，妥布霉素滴眼液和妥布霉素地塞米松滴眼液(美國愛爾康公司)，鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥中國有限公司)，一次性無菌胰島素注射器(上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團有限公司，1 ml，U40)。

1.4感染模型建立

1.4.1實驗分組 60只豚鼠隨機分為4組。每只豚鼠左眼為實驗組，右眼為對照組。實驗組第1組為劃痕法接種1.0×106CFU/ml孢子懸液20 μl，第2組為劃痕法接種1.0×107CFU/ml孢子懸液20 μl，第3組為角膜基質(zhì)注射法接種1.0×106CFU/ml孢子懸液20 μl，第4組角膜基質(zhì)注射法接種1.0×106CFU/ml孢子懸液20 μl；對照組以同樣方式接種含0.1%吐溫80的無菌生理鹽水20 μl。

1.4.2以病原菌感染角膜 豚鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3～0.35 ml/100 g)全身麻醉后，用鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼進行眼部表面麻醉，用妥布霉素滴眼液沖洗眼部后，在手術(shù)顯微鏡下對實驗組接種茄病鐮刀菌孢子懸液。第1組和第2組用15號手術(shù)刀刮除角膜上皮組織，劃痕處理淺基質(zhì)層后分別接種不同濃度孢子懸液20 μl，縫合眼瞼(24 h后打開瞼裂)。第3組和第4組以一次性無菌胰島素注射器沿角膜緣進針，于瞳孔中央處向角膜前中基質(zhì)內(nèi)注入孢子懸液20 μl。對照組以同樣方式接種含0.1%吐溫80的無菌生理鹽水。接種后次日開始用妥布霉素地塞米松滴眼液滴眼，1次/d，連續(xù)14 d。

1.4.3感染癥狀觀察 逐日觀察豚鼠角膜感染情況，記錄角膜水腫程度、感染灶大小、有無角膜潰瘍和新生血管、球結(jié)膜充血程度、前房炎癥反應(yīng)、瞳孔大小和對光反射等特征性表現(xiàn)。

1.4.4組織病理學(xué)檢查 每組分別于接種孢子懸液后的第3、5、7、10、14日各取3只豚鼠，無菌取下角膜，以感染浸潤灶中線為界將其分為兩半。一半角膜用于組織病理學(xué)檢查。通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察角膜炎細胞浸潤和組織壞死情況，過碘酸-雪夫(PAS)染色觀察真菌在角膜組織中的生長情況。

1.4.5病原學(xué)檢查 另一半角膜接種于PDB液體培養(yǎng)基28℃、110 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 d，待有菌絲體生長時，轉(zhuǎn)種至PDA平板培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3～5 d，結(jié)合真菌小瓊脂塊培養(yǎng)法進行形態(tài)學(xué)鑒定，驗證是否為原接種菌株感染。計算各實驗組的真菌培養(yǎng)陽性率。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPPS13.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1豚鼠角膜感染癥狀 豚鼠角膜接種茄病鐮刀菌孢子懸液后，一般狀況良好、無死亡，表現(xiàn)為真菌性角膜炎的典型癥狀。角膜基質(zhì)注射法對角膜上皮無損傷，易于觀察感染癥狀。接種后第3日開始出現(xiàn)角膜水腫增厚、灰白色混濁，球結(jié)膜充血、隱約可見瞳孔等真菌性角膜炎癥狀；第5日接種部位出現(xiàn)密度不均勻、邊緣呈羽毛狀、大小約1 mm×1 mm的灰白色角膜潰瘍灶，睫狀充血嚴重，角膜緣見新生血管，對光反射遲鈍；第7日角膜潰瘍程度加重、面積增大，角膜表面可見干性膏狀隆起，角膜基質(zhì)破潰，出現(xiàn)前房積膿；第10日后部分模型可見角膜上皮修復(fù)，角膜及虹膜大量新生血管向心性長入，病情趨于轉(zhuǎn)歸。對照組接種后第2～3日可見角膜輕度水腫、對光反射正常，第4天后恢復(fù)正常。角膜劃痕法由于創(chuàng)面深淺不一，還易損傷組織，導(dǎo)致不易觀察感染癥狀；同時接種的孢子懸液易外漏，難以控制感染劑量，大部分模型于感染后分泌物明顯增多，于第5～7日出現(xiàn)角膜上皮修復(fù)、病情轉(zhuǎn)歸的表現(xiàn)。

2.2組織病理學(xué)檢查結(jié)果 茄病鐮刀菌感染后，豚鼠角膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。角膜基質(zhì)注射實驗組感染后第3日HE染色可見角膜細胞壞死、膠原斷裂，基質(zhì)層內(nèi)有大量炎細胞浸潤；對照組角膜上皮和后彈力層結(jié)構(gòu)完整、細胞形態(tài)正常(圖1A、1B)。感染后第5日PAS染色可見角膜上皮組織缺損，病原菌大量生長繁殖，向角膜基質(zhì)深層蔓延，真菌菌絲細長、分隔、銳角分枝，平行或斜行于角膜板層生長(圖1C、1D)。感染后第10日PAS染色可見單位面積內(nèi)病原菌菌絲密度增大，炎細胞浸潤明顯增多，角膜上皮破潰，后彈力層缺損，在潰瘍處可見由大量真菌菌絲、炎細胞、壞死組織及溶解膠原混合形成的慢性肉芽腫(圖1E、1F)。

A：實驗組第4組第3天(×400,HE)；B：對照組第3天(×400，HE)；C～F組：實驗組第4組，PAS染色，C、D為第5日，E、F為第10日，C、E為×100，D、F為×400

2.3病原學(xué)檢查結(jié)果 豚鼠感染角膜的分離株在PDA平板培養(yǎng)基上生長迅速，菌落呈棉絮狀，正面呈白色、背面呈淺黃色。顯微鏡下觀察可見菌絲有隔；大分生孢子數(shù)量較多、壁厚、呈鐮刀形，小分生孢子呈臘腸樣、多以假頭狀著生；培養(yǎng)時間較長時可產(chǎn)生厚壁孢子(圖2)。分離株形態(tài)與原接種菌株一致，表明該模型建立成功。真菌培養(yǎng)陽性率最高的是實驗組第4組，達93%(14/15)，實驗組第1、2、3組分別為27%(4/15)、47%(7/15)、67%(10/15)，對照組無真菌生長。不同感染方式組間比較差異顯著(χ2=15.561，P=0.002)。

大分生孢子和小分生孢子 厚壁孢子

3 討 論

與真菌性角膜炎的發(fā)病率不斷增高相比，其早期準確診斷、病原菌致病機制和耐藥機制探討、有效抗真菌藥的研發(fā)則較滯后，導(dǎo)致臨床診治困難，嚴重影響患者的健康及生活質(zhì)量。因此，建立良好的實驗動物模型對真菌性角膜炎的基礎(chǔ)和臨床研究具有重要意義。

真菌性角膜炎動物模型成功與否，與采用何種方法感染病原菌有關(guān)。已報道的病原菌接種方法主要有角膜劃痕法〔12〕、角膜基質(zhì)注射法〔13〕、接觸鏡法〔14〕、角膜植片法〔15〕及針刺法〔16〕，其中前兩種方法比較常用。感染動物常選擇角膜較大的兔或豚鼠，以便于操作和觀察〔13,14,17,18 〕。

本研究根據(jù)吉林省真菌性角膜炎的病原學(xué)及流行病學(xué)分析結(jié)果，選擇感染最常見的、耐藥程度較高的茄病鐮刀菌作為感染菌株，以價格更便宜的豚鼠為實驗動物，比較了角膜劃痕法和角膜基質(zhì)注射法及兩個不同接種濃度對建立真菌性角膜炎動物模型的影響。結(jié)果表明，劃痕法所致創(chuàng)面深淺不一，不利于觀察，且不易控制感染菌量，角膜病變較輕，易自愈，感染率較低；而基質(zhì)注射法角膜上皮無損傷，易觀察感染癥狀，且易于控制感染菌量，角膜病變較重，且較持久，感染率較高。由于角膜大小限制了接種劑量，導(dǎo)致接種濃度越高感染率越高，癥狀出現(xiàn)更早、感染程度更重。

4 參考文獻

1Shokohi T,Nowroozpoor-Dailami K,Moaddel-Haghighi T. Fungal keratitis in patients with corneal ulcer in Sari,Northern Iran〔J〕. Arch Iran Med,2006;9(3): 222-7.

2Shukla PK,Kumar M,Keshava GB. Mycotic keratitis: an overview of diagnosis and therapy〔J〕. Mycoses,2008;51(3): 183-99.

3Thomas PA. Fungal infections of the cornea〔J〕. Eye (Lond),2003;17(8): 852-62.

4Kalkanci A,Ozdek S. Ocular fungal infections〔J〕. Curr Eye Res,2011;36(3): 179-89.

5高新蕊,蘇 晶,崔紅平. 真菌性角膜炎發(fā)病機制的研究進展〔J〕. 中國醫(yī)療前沿(上半月),2007;02(21): 38-40,49.

6鐘文賢,孫士營,趙 靖,等. 1054例化膿性角膜炎的回顧性分析〔J〕. 中華眼科雜志,2007;43(3): 245-50.

7Xie L,Zhong W,Shi W,etal. Spectrum of fungal keratitis in north China〔J〕. Ophthalmology,2006;113(11): 1943-8.

8王麗婭,王剛生. 中國三地區(qū)真菌性角膜病致病菌種的調(diào)查〔J〕. 中華眼科雜志,2000;36(2): 138-40.

9He D,Hao J,Zhang B,etal. Pathogenic spectrum of fungal keratitis and specific identification of Fusarium solani〔J〕. Invest Ophth Vis Sci,2011;52(5): 2804-8.

10Sirikul T,Prabriputaloong T,Smathivat A,etal. Predisposing factors and etiologic diagnosis of ulcerative keratitis〔J〕. Cornea,2008;27(3): 283-7.

11賀 丹,萬 雪,高 嵩,等. 真菌性角膜炎的病原學(xué)分析及鑒定. 中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志〔J〕,2014;34(1): 19-22.

12Mitchell BM,Wu TG,Jackson BE,etal. Candida albicans strain-dependent virulence and Rim13p-mediated filamentation in experimental keratomycosis〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci,2007;48(2): 774-80.

13Yavas GF,Ozturk F,Kusbeci T,etal. Antifungal efficacy of voriconazole,itraconazole and amphotericin b in experimental fusarium solani keratitis〔J〕. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2008;246(2):275-9.

14Goldblum D,Frueh BE,Sarra GM,etal. Topical caspofungin for treatment of keratitis caused by Candida albicans in a rabbit model〔J〕. Antimicrob Agents Chemother,2005;49(4): 1359-63.

15杜 蕊,吳 潔,馬吉獻,等. 兔曲霉菌性角膜炎動物模型建立及角膜共焦顯微鏡檢查〔J〕. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006;27(21): 1925-8.

16Wu TG,Wilhelmus KR,Mitchell BM. Experimental keratomycosis in a mouse model〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci,2003;44(1): 210-6.

17Vijay AK,Sankaridurg P,Zhu H,etal. Guinea pig models of acute keratitis responses〔J〕. Cornea,2009,28(10): 1153-9.

18Cole N,Hume EB,Vijay AK,etal. In vivo performance of melimine as an antimicrobial coating for contact lenses in models of CLARE and CLPU〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci,2010;51(1): 390-5.