Tau蛋白 O-GlcNAc糖基化修飾與阿爾茨海默病相關(guān)性研究進(jìn)展

李琳琳 劉 曼 鄢 錕 張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)進(jìn)行性退變的疾病，其組織病理學(xué)典型改變?yōu)棣碌矸蹣与某练e而成的老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)增生〔1〕。早在1986年就已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)是由過度異常磷酸化的Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)高度螺旋化形成〔2〕。近年來Tau蛋白與AD之間的研究成為熱點(diǎn)，大量證據(jù)表明：Tau蛋白異常磷酸化在神經(jīng)退行性變中起著關(guān)鍵作用。同時，0位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化日趨成為新的熱點(diǎn)，并為AD防治提供了新的藥物靶點(diǎn)。

1 Tau蛋白與異常磷酸化

Tau蛋白是1975年發(fā)現(xiàn)的一種微管相關(guān)蛋白，它由位于17號染色體上一個單一基因編碼而成，在成人大腦，Tau蛋白由其前體mRNA選擇性剪接表達(dá)形成6個亞型〔3〕。Tau蛋白理論上有80個絲氨酸/蘇氨酸和5個酪氨酸位點(diǎn)，目前聚集成雙股螺旋絲(PHF)的異常磷酸化的Tau(PHF-tau)中已鑒定出45個磷酸化位點(diǎn)〔4〕。正常情況下，每分子摩爾Tau蛋白被2～3 mol磷酸磷酸化，但在AD患者腦中磷酸化程度是正常情況的3～4倍〔5〕。Tau蛋白的磷酸化主要受細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶及蛋白磷酸酯酶的調(diào)節(jié)，并且處于動態(tài)平衡狀態(tài)〔6〕。在AD病人的腦中這種平衡被破壞，蛋白激酶的上調(diào)和磷酸酯酶下調(diào)，促使 Tau蛋白異常過度磷酸化。

Tau蛋白生物學(xué)功能包括催化微管進(jìn)一步裝配，穩(wěn)定微管自身結(jié)構(gòu)以及影響軸突的運(yùn)輸速度等。Tau蛋白的異常磷酸化使Tau蛋白功能異?；踔羻适?，最終引起神經(jīng)退行性疾病，包括：(1) Tau 蛋白的過度磷酸化使其喪失正常生物活性，在一定程度上抑制Tau蛋白與微管的結(jié)合，從而使Tau蛋白喪失刺激微管組裝并維持微管穩(wěn)定性的功能〔7〕；(2) Tau 蛋白某些位點(diǎn)的過度磷酸化導(dǎo)致Tau蛋白更易形成絲狀二聚體，最終相互聚合為PHFs，構(gòu)成NFT〔8〕。

研究〔9〕發(fā)現(xiàn)大鼠缺血/再灌注后，腦皮質(zhì)的Tau蛋白發(fā)生高度磷酸化，表明缺血缺氧可能是Tau蛋白過度磷酸化的影響因素之一。同時，有報(bào)道〔10〕稱tau的聚集產(chǎn)生細(xì)胞毒性。相反，另一些報(bào)道〔11〕則認(rèn)為Tau的聚集與細(xì)胞毒性不相干，聚集的Tau喪失自身促進(jìn)微管組裝的生物活性，然而使異常過度磷酸化的Tau和PHF重新去磷酸化，轉(zhuǎn)換成類似正常的蛋白，可顯著恢復(fù)Tau的生物活性。

有研究組〔11〕通過基因抑制表達(dá)阻止神經(jīng)元進(jìn)一步丟失，卻發(fā)現(xiàn)無須去除或阻止其他神經(jīng)纖維病理性積累。說明神經(jīng)元丟失可以發(fā)生在NFT形成之前，兩者獨(dú)立存在，NFT形成并不一定會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡?，F(xiàn)在，Bonda團(tuán)隊(duì)〔12〕也對經(jīng)典觀念提出挑戰(zhàn)，認(rèn)為Tau蛋白磷酸化對機(jī)體有保護(hù)作用，是神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激的代償性反應(yīng)。這一觀點(diǎn)從另一個角度闡釋了潛在的病理生理學(xué)機(jī)制，能為治療干預(yù)提供新視角。同時，這一觀點(diǎn)也得到Wang等〔13〕認(rèn)同，認(rèn)為Tau過度磷酸化/聚集可能具有保護(hù)性，特別是當(dāng)細(xì)胞暴露在急性損害下，其給予細(xì)胞更多抗凋亡的能力，使神經(jīng)元逃脫急性凋亡，因而阻止大腦喪失大量細(xì)胞。但是過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經(jīng)元始終是喪失正常的生理功能的病態(tài)神經(jīng)元，這些被延長生存時限的神經(jīng)元不易對抗環(huán)境或代謝的損害，同時又容易形成NFT，因此過度磷酸化造成了緩慢而漸進(jìn)的神經(jīng)元退行性變性。

新的假說認(rèn)為Tau蛋白磷酸化誘導(dǎo)“流產(chǎn)凋亡”可能是一個進(jìn)化的機(jī)制，可以讓神經(jīng)元從凋亡打擊中存活，并等待自我修復(fù)機(jī)會。通過對AD中Tau磷酸化不同階段進(jìn)行調(diào)控，可能找到拯救細(xì)胞退化凋亡的潛在機(jī)會。這個假說具有一定啟發(fā)性，但是Tau的過度磷酸化是如何使細(xì)胞逃脫急性凋亡？并且到達(dá)何種階段才能有自我修復(fù)的機(jī)會？則需要更多的實(shí)驗(yàn)支持和證據(jù)。

2 O-GlcNAc糖基化修飾與糖代謝

主要由過度磷酸化構(gòu)成的NFT是AD的一個重要病理特征，而其他翻譯后修飾的形式，例如糖基化、硝基化、截?cái)?、乙?；?、泛素化等也會影響Tau的磷酸化或聚集，特別是糖基化修飾越發(fā)引起人們的興趣。

O-GlcNAc糖基化，是一種動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。受O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(OGA)調(diào)節(jié)，單糖的o-GlcNAc在OGT的催化下，經(jīng)由0-糖苷鍵從UDP-GlcNAc供體轉(zhuǎn)移并連接至蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基上。OGA的功能是將O-GlcNAc從蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基上去除〔14〕。

早在1996年，Arnold等〔15〕首先發(fā)現(xiàn)從牛腦中分離出來Tau受O-GlcNAc的修飾。此后在2004年，研究者〔16〕從人類尸檢中提純的Tau被O-GlcNAc糖基化修飾。Yuzwa等〔17〕使用一個兔多克隆IgG抗體在大鼠腦組織中檢測到受O-GlcNAc糖基化修飾的Tau蛋白絲氨酸400位點(diǎn)。

事實(shí)上AD的病理生理特點(diǎn)之一是糖代謝障礙。從輕度認(rèn)知功能障礙、記憶能力減退發(fā)展到行為障礙及精神問題，老年癡呆的進(jìn)展與糖代謝損害的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Gong等〔18〕動物實(shí)驗(yàn)表明，減少葡萄糖攝入和代謝可減少Tau蛋白的糖基化，引起Tau蛋白的異常磷酸化和聚集，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退行性變和AD的發(fā)生。同時,Liu等〔19〕采用己糖胺途徑抑制劑處理小鼠大腦，造成Tau蛋白O-GlcNAc糖基化水平減少和磷酸化水平增加。

其中糖代謝異常是如何影響AD的呢？現(xiàn)在認(rèn)為O-GlcNAc糖基化不僅受OGT和OGA的調(diào)節(jié)，還受到細(xì)胞內(nèi)UPD-GlcNAc水平的影響〔13〕。因?yàn)閺墓w角度而言，O-GlcNAc糖基化修飾的供體底物為UDP-GlcNAc，它是以葡萄糖為原料經(jīng)過己糖胺途徑合成的終產(chǎn)物。但環(huán)境或代謝發(fā)生改變時，機(jī)體葡萄糖攝取或代謝能力下降，引起細(xì)胞內(nèi)UPD-GlcNAc減少，致O-GlcNAc糖基化水平下調(diào)，從而進(jìn)一步影響磷酸化水平。見圖1。

Kinase：蛋白激酶；phosphatase：蛋白磷酸酯酶；HBP：己糖胺合成途徑

3 O-GlcNAc糖基化與磷酸化

O-GlcNAc糖基化功能上類似于磷酸化。在調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程，如轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中起到了重要作用〔20〕。近年來很多的研究證實(shí)：O-GlcNAc糖基化修飾在AD中舉足輕重，通過負(fù)調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化影響AD的發(fā)生發(fā)展，兩者存在著一種相互平衡的機(jī)制。

錢慰等〔21〕以腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞作為模型，采用非毒性的方法(高糖培養(yǎng)、OGT轉(zhuǎn)染)使細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化水平升高，結(jié)果表明Ser214，Ser262，Ser356，Ser396和Ser404等位點(diǎn)的磷酸化水平降低。Liu等〔16〕從兩個方面證實(shí)糖基化在一些位點(diǎn)上負(fù)性調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化。他首先用OGA抑制劑處理PC12細(xì)胞增加糖基化水平，Tau蛋白多個位點(diǎn)的磷酸化明顯受到抑制。此外，在經(jīng)過饑餓處理的小鼠動物模型中，通過模仿葡萄糖攝取或代謝機(jī)制的損害，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化降低，在Tau大多數(shù)的磷酸化位點(diǎn)出現(xiàn)異常過度磷酸化。在隨后研究中他們發(fā)現(xiàn)在AD患者大腦中，過度磷酸化的Tau較未過度磷酸化的Tau中O-GlcNAc水平減少了5倍，并且第一次證實(shí)在人類大腦中O-GlcNAc糖基化與磷酸化的反向關(guān)系〔19〕。王景景等〔22〕發(fā)現(xiàn)提高CHO-K1細(xì)胞的O-糖基化水平有助于減輕突變型Tau蛋白的過度磷酸化水平，改善細(xì)胞軸突轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Smet-Nocca等〔23〕發(fā)現(xiàn)Tau蛋白的3個O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)S400、S396和S404，其中相鄰殘基Ser-396和Ser-404的磷酸化可以顯著降低S400的糖基化。相反，Ser-400的糖基化通過中斷糖原合成激酶3β(GSK3β)介導(dǎo)的連續(xù)磷酸化過程從而減少S404的磷酸化。

基于目前的研究，現(xiàn)在明確的是O-GlcNAc糖基化因與磷酸化競爭相應(yīng)絲氨酸和(或)蘇氨酸殘基位點(diǎn)，從而抑制Tau蛋白的過度異常磷酸化水平，影響Tau聚集成NFTs，減緩AD發(fā)生發(fā)展。見圖1。另外還有觀點(diǎn)提出Tau蛋白的 O-GlcNAc糖基化修飾可能限制tau蛋白聚集，減少其帶來的毒性，并且促進(jìn)其在細(xì)胞環(huán)境中的整體穩(wěn)定性〔24〕。又有新的觀點(diǎn)表明O-GlcNAc糖基化和磷酸化在調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)對代謝/應(yīng)激信號中，存在廣泛的串聯(lián)及位點(diǎn)特異性相互作用〔25〕。但是兩者具體通過何種不同機(jī)制互相交叉而又各異影響仍不甚明確。

4 關(guān)于thiamet-G

2007年在我國進(jìn)行的一項(xiàng)系統(tǒng)分析研究得出：我國60歲以上人群中AD患病率約為1.6%〔26〕。2013年波士頓阿爾茲海默病協(xié)會國際會議上，成立了AD全球CEO計(jì)劃(CEOi)。為此，早期預(yù)防、藥物研發(fā)提出更高的要求。臨床上用于治療AD患者的藥物基本只用于減緩病情發(fā)展，改善癥狀。從20世紀(jì)80年代末期開始，研究開發(fā)主要針對阻止β淀粉樣肽沉積的藥物。目前隨著AD發(fā)病機(jī)制研究深入，更多的研究者把目光投向Tau蛋白作為AD治療靶點(diǎn)?？v觀國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀，基于Tau蛋白磷酸化酶的藥物研發(fā)居多，而關(guān)于直接抑制Tau蛋白聚集從而阻止NFT形成的藥物研究尚處于起步階段。

隨著Tau蛋白的磷酸化及其O-GlcNAc糖基化與AD研究的逐漸深入，研究者們研制出了可以有效提高O-GlcNAc水平的OGA抑制劑thiamet-G，它是最近幾年研究合成的強(qiáng)效的OGA抑制劑。

Yu等〔27〕研究報(bào)道證實(shí)了向小鼠的側(cè)腦室注射thiamet-G可以增加O-GlcNAc糖基化水平。急性大劑量注射thiamet-G不僅可以直接逆向調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化，同時也可以刺激GSK-3β活性，從而調(diào)控Tau蛋白的磷酸化，同時有位點(diǎn)特定性和雙向性。Yuzawa等〔28〕報(bào)道表明thiamet-G能減少類神經(jīng)PC-12細(xì)胞中Tau蛋白病理相關(guān)位點(diǎn)Thr231和Ser396的磷酸化，它可以迅速通過血腦屏障，提高哺乳動物O-GlcNAc糖基化水平，使大鼠大腦皮層及海馬區(qū)Thr231、Ser396和Ser422磷酸化水平下降。并且在隨后的實(shí)驗(yàn)中再次證實(shí)thiamet-G是能夠減緩tau蛋白驅(qū)動的神經(jīng)退行性疾病的選擇類化合物，并且沒有明顯副作用〔24〕。通過細(xì)胞水平和動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示thiamet-G確實(shí)能通過影響O-GlcNAc糖基化水平，從而競爭抑制磷酸化程度，但其改善和減緩神經(jīng)退行性變的作用效果還需要更多的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，由Tau蛋白過度磷酸化構(gòu)成的NFT在AD進(jìn)展中至關(guān)重要，在損害初期可能幫助細(xì)胞逃脫急性凋亡，但是最后總體還是造成神經(jīng)退行性改變，其中不同時段的調(diào)控機(jī)制尚不明確。葡萄糖攝取或代謝受損是AD患者大腦早期的病理機(jī)制之一，直接影響糖基化水平。近年來隨著Tau蛋白磷酸化與O-GlcNAc糖基化之間負(fù)相關(guān)調(diào)控機(jī)制得以驗(yàn)證，強(qiáng)效的OGA抑制劑thiamet-G為防治AD提供了新視角。相信隨著研究深入，以此為靶點(diǎn)的藥物將有望運(yùn)用于臨床藥物研發(fā)，為AD患者帶來福音。

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