缺氧誘導(dǎo)因子-1α對SD大鼠心室肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的短暫保護(hù)作用

范林洋 張娜娟 邵 鑫 李小雪 陳 芬 楊春蕾

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，四川 成都 610041)

缺氧缺血性心腦血管病已成為我國發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的疾病〔1〕。再灌注曾經(jīng)被認(rèn)為是治療缺血缺氧心臟疾病的有效手段，而再灌注后引起的心肌壞死與功能障礙已成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題〔2〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是1992年在研究缺氧誘導(dǎo)的促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下廣泛存在于人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)〔3〕。HIF-1α的分布和作用十分廣泛，在胚胎發(fā)育、缺血缺氧性疾病及腫瘤的發(fā)展中起著重要作用。但是在心肌細(xì)胞水平HIF-1α?xí)r效問題的研究目前還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討短暫及長時(shí)間HIF-1α對心室肌細(xì)胞缺血再灌注損傷(IRI)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠新生乳鼠(1～3 d)，雌雄不拘，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川) 2006-010。

1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(TaKaRa)，DNA連接酶SolⅠ(TaKaRa)，質(zhì)粒小量提取試劑盒，Ⅱ型膠原酶(GIBCO)、透明質(zhì)酸酶(Sigma)、MTT(Sigma)、LipofectamineTM2000(Invitrogen) 、兔抗鼠Bcl-2、VEGF及HIF-1α單克隆抗體(北京中杉公司)；模擬缺血液和模擬再灌注液均參考張娜娟的實(shí)驗(yàn)方法配制；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3方法

1.3.1真核表達(dá)載體pcDNA3.1-full length HIF-1α的構(gòu)建和鑒定 質(zhì)粒pSPT18-full length HIF-1α由美國Hokkaido大學(xué)Jian Chen博士惠贈，pcDNA3.1及大腸桿菌JM109均由華西婦產(chǎn)兒童醫(yī)院室屈藝教授提供。將pSPT18-full length HIF-1α及pcDNA3.1兩個(gè)質(zhì)粒分別用BamHⅠ單酶切，膠回收所取片段后DNA連接酶SolⅠ連接。將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109，提取質(zhì)粒質(zhì)粒。BamHⅠ單酶切，測序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.3.2心室細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化 按照張娜娟等所描述的聯(lián)合酶消化法分離心室肌細(xì)胞〔4〕。取出生1～3 d的乳鼠10只，取心臟，在PⅡ緩沖液中去除心包膜及心房，取心室部分剪碎并消化，200目細(xì)胞篩過濾并接種至培養(yǎng)瓶，1 h后取出細(xì)胞懸液(此時(shí)大部分成纖維細(xì)胞貼壁)離心并接種于培養(yǎng)瓶。

1.3.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染心室肌細(xì)胞 將提前準(zhǔn)備好心室肌細(xì)胞接種于30 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)，換成無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。按8 μg質(zhì)粒+40 μl LipofectamineTM轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3.4體外心肌細(xì)胞IRI模型的建立 參照張娜娟等的研究方法〔4〕，建立體外心肌細(xì)胞IRI模型。將實(shí)驗(yàn)分成缺血再灌注(IR)后正常培養(yǎng)6 h檢測和IR后正常培養(yǎng)5 d再進(jìn)行檢測兩個(gè)體系，每個(gè)體系分成4組：對照組，I/R組(正常心室肌細(xì)胞IR組)，I/R+full(轉(zhuǎn)染HIF-1α的IR組)和I/R+NC(轉(zhuǎn)染空載的IR組)。

1.3.5MTT檢測心室肌細(xì)胞活力 收集各組細(xì)胞，按2×104/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。孵育24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT20 μl，孵育4 h后吸除上清，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，酶標(biāo)儀上檢測吸光值(λ=570 nm)。

1.3.6Western印跡檢測HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達(dá) 胰酶消化各組細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS液洗3次后，加入含有亮胰蛋白酶肽(10 μg/ml)，抑肽酶(10 μg/ml)和苯甲基磺酰氟(PMSF，100 μg/ml)的細(xì)胞裂解液400 μl，置于冰上10 min，再經(jīng)沸水浴10 min，離心取上清，收集于新的EP管中。BCA蛋白檢測試劑盒定量后，取50 μg上樣，120 V電泳1.5 h，50 V轉(zhuǎn)膜45 min后，將膜置于封閉液中封閉1 h。將PVDF膜與TBST稀釋的一抗HIF-1α(1∶250)、VEGF(1∶250)、β-actin(1∶250)進(jìn)行孵育4℃過夜；TBST洗膜，將膜放入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，洗膜4次，化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.3.7免疫細(xì)胞化學(xué)分析 將消毒好的蓋玻片放入6孔板，按5×106接種細(xì)胞于蓋玻片上，孵育4 h后每孔加入2 ml培養(yǎng)液，20 h后按免疫組化染色試劑盒說明書操作?？贵w使用bcl-2(1∶200)。采用Image-Pro Plus 4.5分析軟件陽性表達(dá)的積分光密度值，計(jì)算平均IOD。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集四組各1×106個(gè)細(xì)胞，900 r/min離心5 min去上清，反復(fù)兩次，重懸于500 μl PBS溶液中；將細(xì)胞懸液放置于2～3 ml預(yù)冷的70%乙醇中，混勻，4℃保存30 min。上機(jī)前去除固定液，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，加50 μl碘化丙啶(PI，0.4 mg/ml)，0℃～4℃染色30 min后，F(xiàn)ACS-420流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1酶切結(jié)果 對構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-full length HIF-1α用BamHⅠ酶切后，可見5.4 kb及2.5 kb兩個(gè)條帶出現(xiàn)，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。之后質(zhì)粒測序驗(yàn)證結(jié)果也證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。見圖1。

1：DNA marker DL15000，2：KpnⅠ酶切pcDNA3.1，3：pcDNA3.1，4：BamHⅠ酶切pcDNA3.1，5：pcDNA3.1-full length HIF-1α digested by BamHⅠ，6：pcDNA3.1-full length HIF-1α，7：DNA marker λEcoT14

圖1重組質(zhì)粒pcDNA3.1-fulllengthHIF-1α酶切圖

2.2MTT測定細(xì)胞活力 在IR后培養(yǎng)6 h檢測體系中，與對照組(0.85±0.09)相比，IR組(0.57±0.04)和I/R+NC組(0.60±0.08)心肌細(xì)胞活性明顯降低；而I/R+full組(0.78±0.10)IR處理后的心肌細(xì)胞活性出現(xiàn)一定程度的改善。正常培養(yǎng)5 d后，I/R+full組(0.52±0.03)細(xì)胞活力卻大幅度降低，與IR組(0.42±0.07)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常培養(yǎng)5 d IR組與IR+NC組(0.57±0.05),對照組(0.77±0.06)無明顯差異(P>0.05)。

2.3Western印跡檢測 見圖2，IR處理6 h后，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比：IR組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-full length HIF-1α的心室肌細(xì)胞VEGF表達(dá)量明顯增加，且二者呈正相關(guān)趨勢；在處理5 d后，重組質(zhì)粒組的HIF-1α表達(dá)仍然較高，但VEGF的表達(dá)顯著下降。

2.4免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 在IR后培養(yǎng)6 h檢測體系中，與IR組相比，I/R+full組bcl-2表達(dá)較高，而I/R組bcl-2表達(dá)下降。但I(xiàn)R組后培養(yǎng)5 d檢測，I/R+full組bcl-2大幅度下降。見表2。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 與對照組相比，IR 6 h后心室肌細(xì)胞凋亡率顯著增加；與IR組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后凋亡程度明顯下降。但繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組凋亡率明顯上升，與I/R組比較相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

1～4：對照組；I/R；I/R+full;I/R+NC處理6 h后；處理5 d后

表2 各組心室肌細(xì)胞bcl-2基因陽性表達(dá)±s,n=6)

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較±s，%,n=6)

3 討論

IR已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視〔5〕。研究表明再灌注后反而會引起細(xì)胞或組織代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞等不可逆損傷，即IRI〔6〕。細(xì)胞凋亡是IR組織損傷功能喪失的重要原因，如何有效減輕和防治IR引起的心臟疾病和心肌損傷越來越受到人們的重視。

HIF-1α與心肌缺血、心肌細(xì)胞凋亡及心力衰竭等各種心血管疾病有關(guān)〔7，8〕。Wang等〔9〕對新生鼠研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在缺氧/復(fù)氧狀態(tài)下對心肌細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用，HIF-1α可以通過調(diào)節(jié)bcl-2等凋亡相關(guān)基因參與細(xì)胞凋亡的過程。

VEGF是相對分子質(zhì)量34～46 kD的熱穩(wěn)定蛋白，序列保守。普遍認(rèn)為，心肌缺血后，HIF-1α和VEGF等基因的表達(dá)，可以促進(jìn)缺血心肌形成新生血管，表現(xiàn)為心肌毛細(xì)血管密度及血流量增加，導(dǎo)致心肌肥大〔7〕。本研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在細(xì)胞短期缺血缺氧的環(huán)境下，能誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，促進(jìn)缺氧細(xì)胞對缺氧的耐受，保障細(xì)胞的存活。

bcl-2蛋白家族是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)在IR人黑色素瘤細(xì)胞中，bcl-2可以誘導(dǎo)HIF-1和VEGF高表達(dá)〔11，12〕。本研究說明HIF-1α可通過刺激bcl-2的表達(dá)阻止心肌細(xì)胞凋亡；細(xì)胞經(jīng)IR處理后恢復(fù)其良好的培養(yǎng)條件HIF-1α并沒刺激bcl-2的高表達(dá)，HIF-1α對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用只是暫時(shí)的。本研究結(jié)果說明HIF-1α長時(shí)間的激活狀態(tài)并未對心肌細(xì)胞RI起到保護(hù)作用。Marion H?lscher等〔13〕也發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性心臟病中HIF-1α只是短期內(nèi)對心臟有益，與本研究在細(xì)胞水平研究的結(jié)果一致。

4 參考文獻(xiàn)

1夏 強(qiáng),錢令波.心腦缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治策略研究進(jìn)展〔J〕.2010；39(6):551-8.

2唐朝樞.冠心病心肌損傷基礎(chǔ)研究的進(jìn)展〔R〕.中華醫(yī)學(xué)會第十一次全國心血管病學(xué)術(shù)會議專題報(bào)告匯編，2009:33.

3Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation〔J〕.Mol Cell Biol，1992；12(12)：5447-54.

4張娜娟,張彤彤,劉志祥,等.體外心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型的建立〔J〕.四川動(dòng)物，2009；28(3)：440-3.

5Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，etal.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog〔J〕.Arch Pathol，1960；70(1)：68-78.

6王曉良.應(yīng)用分子藥理學(xué)〔M〕.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2005：215-6.

7Martin C，Yu AY.Cardiac hypertrophy in chronically anemic fetal sheep:Increased vascular endothelial growth factor and hypoxia inducible factor 1〔J〕.Am J Obstet Gynecol，1998；178(3)：527-34.

8Spinella F，Rosanò L，Di Castro V，etal.Endothelin-1 induces vascular endothelial growth factor by increasing hypoxia-inducible factor-1 in ovarian carcinoma cells〔J〕.J Biol Chem,2002;277(31)：27850-5.

9Wang X，Ma S，Qi G.Effect of hypoxia-inducible factor 1-alpha on hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in primary neonatal rat cardiomyocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2012；417(4)：1227-34.

10楊連君,曹雪濤,于益芝.Bcl-2，bax與腫瘤細(xì)胞凋亡〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2003；10(3)：232-4.

11Iervolino A，Trisciuoglio D，Ribatti D，etal.Bcl-2 overexpression in human melanoma cells increases angiogenesis through VEGF mRNA stabilization and HIF-1-mediated transcriptional activity〔J〕.The FASEB J，2002；16(11):1453-5.

12Trisciuoglio D，Gabellini C，Desideri M，etal.Involvement of BH4 domain of bcl-2 in the regulation of HIF-1-mediated VEGF expression in hypoxic tumor cells〔J〕.Cell Death Diffe，2011；18:1024-35.

13Marion H?lscher，Katrin Sch?fer，Sabine Krull，etal.Unfavourable consequences of chronic cardiac HIF-1α stabilization〔J〕.Cardiovasc Res，2012；94(1)：77-86.