不同劑量補陽還五湯對脊髓損傷大鼠后肢運動功能的影響

賀小平 董賢慧 趙靜怡 徐 倩 郝云濤 張夢鑫

(承德醫(yī)學院脊髓損傷與修復研究室，河北 承德 067000)

最常見的脊髓損傷(SCI)多來自于外傷所致脊柱骨折或骨折脫位。SCI預后很差，致殘率極高，是造成癱瘓的主要原因，給社會、家庭和個人均帶來了巨大的負擔。因此，SCI是全世界神經(jīng)科學領域所面臨的一個巨大難題。SCI所致的偏癱、截癱或肢體痿軟等癥，中醫(yī)認為屬于督脈損傷，瘀血阻絡，加之患者元氣大傷且久臥傷氣，多見氣虛血瘀癥所以用BYHWD治療SCI可以有良好的療效。補陽還五湯(BYHWD)出自清代名醫(yī)王清任所著的《醫(yī)林改錯》，由生黃芪、川芎、當歸尾、地龍、桃仁、紅花、赤芍等7味藥物組成，諸藥合用共奏益氣活血通絡之功，原用于氣虛血瘀型中風所致半身不遂、口眼歪斜、語言謇澀等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明BYHWD具有改善血液流變學、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、保護神經(jīng)及促神經(jīng)生長、抗腦缺血再灌注損傷及抗心肌缺血等作用〔1，2〕。本研究旨在探討不同劑量BYHWD對SCI后肢運動功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雌性Wistar大鼠50只，體重(250±5)g，天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供，合格證號：0003327。購進后進行兩周預飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：20℃～29℃，相對濕度40%～60% RH，自由進食水。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、SCI模型組和BYHWD組，其中BYHWD組根據(jù)給藥劑量又分為低、中、高劑量3個亞組，每組10只。

1.2實驗藥品及給藥 BYHW的制備及給藥方法：BYHWD飲片顆粒劑由深圳華潤三九現(xiàn)代中藥有限公司饋贈。其水溶液按《醫(yī)林改錯》原方所載的藥味用量(按文獻每錢以3 g換算)，即生黃芪120 g,當歸尾6 g,赤芍5 g,地龍、川芎、桃仁、紅花各3 g生藥飲片的顆粒劑混勻后；用100℃蒸餾水配制成含生藥飲片2.0 g/ml的BYHWD顆粒劑水溶液備用；各組大鼠連續(xù)灌服2 w，1 次/d，BYHWD中劑量組給藥體積用藥按照3 倍臨床等效劑量換算灌胃給藥，為20 ml/kg，即4 ml/d，高劑量組6 ml/d，低劑量組2 ml/d。給藥時間從術前30 min起,至術后3 w末結束實驗。

1.3大鼠SCI模型的建立 大鼠采用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，剪去大鼠背部毛大約5 cm×3 cm，大鼠以俯臥位固定在手術臺上，對背部常規(guī)消毒鋪無菌單，通過摸肋骨的方法定位T10為中心，作長約4 cm的縱行皮膚切口，依次切開各層皮下組織，顯微器械分開棘突兩側豎脊肌，成功暴露T10棘突及椎板，微型咬骨鉗咬除T10棘突及棘間韌帶，在10倍手術放大鏡下咬除黃韌帶及椎板，成功暴露T10段脊髓硬膜，剪開硬膜，分離包裹在脊髓表面的神經(jīng)根，暴露T10段脊髓，采用自制的“可控擊打器”擊打T10段脊髓，并使重物壓迫脊髓2 min，建立SCI模型，縫合硬膜及傷口。假手術組只需咬除椎板及黃韌帶，保留硬脊膜的完整性，縫合傷口。

1.4大鼠術后護理 術后各組大鼠連續(xù)給予青霉素3 d，預防感染。模型組大鼠每天早中晚3次人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空，大約1～7 d，每天的護理分3個時間段：早8∶00-9∶00為晨間護理，中午2∶00-3∶00為午間護理，晚8∶00-9∶00為晚間護理。

1.5SCI模型制作成功的標準 應符合以下條件：①在手術中顯微鏡下直視脊髓受擊打出現(xiàn)斷端。②擊打大鼠脊髓時出現(xiàn)大鼠尾部痙攣性擺動。術后安靜狀態(tài)下，大鼠后肢癱瘓，鼠尾可出現(xiàn)小幅度不自主的痙攣性擺動，用手指壓迫大鼠的鼠尾，鼠尾可出現(xiàn)痙攣、卷曲、張力過高及抽搐等現(xiàn)象。

1.6對各組大鼠進行BBB評分〔3〕后肢運動功能評分分別在于造模前1 d，造模后1、7、14和21 d進行。評定時間均統(tǒng)一為上午8∶00開始。評分為2人合評。為避免人為因素的干擾，采用雙盲對照進行評分，參評人員均為熟悉本評分標準且不參與本實驗的人員。將動物置于平坦不滑、光線充足的桌面上觀察后肢關節(jié)活動，并對其進行功能評分，第一步(0～7 分)評判后肢關節(jié)活動；第二步(8～13 分)評判動物的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能；第三步(14～21 分)評判動物運動中爪的精細動作。3 項滿分21 分。兩后肢分別評分，記錄平均值。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件包進行方差分析和LSD組間比較。

2 結 果

大鼠麻醉清醒后，假手術組大鼠行走輕度異常，術后1 d完全恢復正常；SCI模型組大鼠損傷平面以下完全癱瘓。術后第1天BYHWD組與SCI模型組大鼠BBB評分未見明顯差異(P>0.05)；術后第7～21天，低劑量BYHWD組與SCI模型組大鼠BBB評分未見明顯差異(P>0.05)；中、高劑量BYHWD組與均高于同期SCI模型組(P<0.05)。見表1。

表1 不同劑量BYHWD對各組大鼠BBB評分的影響±s,n=10)

3 討 論

本實驗采用BBB法評價神經(jīng)運動功能，該法分級細致，幾乎包括了SCI后大鼠后肢恢復過程中所有行為學變化，且與SCI的程度高度相符。因此，本實驗采用該方法進行大鼠后肢運動功能的評分，該法也是目前許多研究者較為推崇的一種方法。

BYHWD是我國傳統(tǒng)的中藥方劑，應用BYHWD治療SCI可以有良好的療效。但其治療SCI的機制目前還不是很清楚。

SCI后的病理生理機制是一個至今仍未解決的極其復雜的過程，其中包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性損傷即引起一系列遲發(fā)性神經(jīng)壞死而造成的損傷，SCI后不同時間段內(nèi)神經(jīng)細胞存活狀態(tài)對于SCI后的神經(jīng)元的潰變、神經(jīng)再生和運動的功能恢復有著非常重要的影響。近年來人們對于SCI后細胞死亡的研究手段大多限于細胞水平，SCI后其超微結構改變的形態(tài)學研究報道并不多見。

繼發(fā)性損傷是SCI后造成脊髓受損的主要因素，最終可造成脊髓的繼發(fā)性缺血、缺氧。缺氧可使細胞內(nèi)水和電解質(zhì)紊亂、酸度增高，還可引起粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及核蛋白體的損傷，使蛋白質(zhì)的合成功能發(fā)生障礙，這些變化可進一步損傷溶酶體膜，導致溶酶體內(nèi)的各種水解酶的激活和釋放，從而更進一步加重了細胞內(nèi)其他結構的損傷。如果損傷過于嚴重，超過細胞自身的代償能力，細胞代謝停止，發(fā)生死亡。

常見的SCI模型建立方法有脊髓壓迫損傷模型、脊髓切割損傷模型、脊髓牽拉損傷模型、脊髓缺血損傷模型、脊髓火器傷模型、化學性損傷、脊髓鉗夾損傷模型、脊髓吸除損傷模型、環(huán)扎法致?lián)p傷、橫向骨折脫位致?lián)p傷等。

本實驗采用自制擊打器建立SCI模型屬于脊髓撞擊損傷模型，此法簡單易行，制作成本低，易于復制，可通過調(diào)整重錘的重量和墜落高度來改變撞擊能量，也可通過調(diào)整打擊板的大小、形狀等來調(diào)整撞擊的部位和范圍，并且保持了硬脊膜完整，可有效防止外源性成分侵入SCI區(qū)域，并防止脊髓外露與腦脊液外漏，是目前與臨床SCI相關性最好的一種。這種模型較接近人類SCI的病理生理特點及變化規(guī)律，造成脊髓水腫、缺血并繼發(fā)一系列損傷，能夠很好地模擬人類脊髓受損的過程，對研究SCI后神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的病理變化、再生規(guī)律和相互作用、探索神經(jīng)保護策略等有較大幫助，因此該法一直沿用至今。

近年來，越來越多的神經(jīng)科學工作者投入到BYHWD治療SCI的研究中來，單參考國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，BYHWD的給藥濃度及藥物劑量均不盡相同。

本實驗推論灌胃給予BYHWD中劑量時已達到最佳治療濃度，再增加藥物濃度已不能增加治療效果，故認為中劑量是BYHWD治療SCI的最佳藥物濃度。

目前，BYHWD治療SCI的機制還不清楚，其可能機制為：①改善損傷后組織的缺血和炎癥反應〔4〕；②抑制細胞凋亡〔5〕，保護神經(jīng)細胞〔6〕；③抑制星形膠質(zhì)細胞對損傷的反應〔7〕；④促進軸突再生作用〔8〕；⑤抑制脂質(zhì)過氧化反應〔9〕；⑥改善損傷后組織水腫〔10〕等。本實驗確定了BYHWD治療SCI的最佳藥物濃度，為進一步研究BYHWD治療脊髓損傷的機制奠定基礎。

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