衰老誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道β1亞基功能下調(diào)

石麗君 劉佰林 劉雨佳 陳 渝

(北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理教研室，北京 100084)

腸系膜動(dòng)脈是主要的外周阻力血管，是局部血流量和血壓的重要調(diào)控部位。除神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)外，動(dòng)脈平滑肌上的鉀離子通道對血管舒縮調(diào)節(jié)亦發(fā)揮重要作用，其中，由于大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)表達(dá)密度高且電導(dǎo)大，因此在血管張力的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮決定性作用〔1，2〕。有研究報(bào)道，增齡可導(dǎo)致某些血管平滑肌BKCa通道功能和表達(dá)下降，如在大鼠和人的冠狀動(dòng)脈，BKCa通道α亞基蛋白表達(dá)下降〔3，4〕，且在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)β1亞基與α亞基表達(dá)平行下降；但是腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道表達(dá)無顯著性變化〔5〕。提示增齡對血管平滑肌細(xì)胞BKCa通道的影響是組織特異性的。然而，衰老對大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的電生理特性有何影響報(bào)道極少。本研究采用膜片鉗技術(shù)探討衰老對大鼠腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌BKCa通道生物物理特性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2月齡健康雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，分別飼養(yǎng)至4～5月齡(青年組，n=6)和22～24月齡(老年組，n=6)。大鼠分籠飼養(yǎng)，老年大鼠每籠1只，青年大鼠每籠3～5只，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食，溫度維持在22℃～24℃，相對濕度40%～60%，按照晝夜節(jié)律人工控制光照。

1.2藥物及溶液配制 牛血清蛋白 (BSA)、I型膠原酶 (type I-S collagenase)、木瓜蛋白酶 (Papain)、F型膠原酶 (type F collagenase)、二硫蘇糖醇 (DDT)、乙二胺四乙酸(EGTA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)均購自美國Sigma公司，其余為國產(chǎn)分析純試劑。

分離平滑肌細(xì)胞緩沖液Ⅰ(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.6，MgCl21.0，葡萄糖10.0，HEPES 10.0，硝普鈉0.03，用NaOH調(diào)pH值至7.4。分離平滑肌細(xì)胞緩沖液Ⅱ(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.6，MgCl21.0，葡萄糖10.0，HEPES 10.0，Na2HPO40.42，NaH2PO40.44，用NaOH調(diào)pH7.4。分離平滑肌細(xì)胞酶液Ⅰ(mg/ml)：BSA 1.0，Papain 0.3，DDT 1.0，溶于分離平滑肌細(xì)胞緩沖液Ⅰ中。分離平滑肌細(xì)胞酶液Ⅱ(mg/ml)：BSA 1.0，F(xiàn)型膠原酶 1.5，I型膠原蛋白1.0，溶于分離平滑肌細(xì)胞緩沖液Ⅰ中。電極內(nèi)液成分(mmol/L)：100 KCl，45 K-Asp，1 EGTA，10 HEPES，葡萄糖(KOH調(diào)節(jié)pH7.4)；浴液成分(mmol/L)：45 KCl，100 K-Asp，1 EGTA，10 HEPES及5 Glucose (KOH調(diào)節(jié)pH7.4)。

1.3大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg /kg)，麻醉后迅速取出腸系膜動(dòng)脈置于4℃無鈣分離液Ⅰ中，小心剝離干凈腸系膜動(dòng)脈上周圍脂肪組織，然后剪取腸系膜A2～A4級小動(dòng)脈(內(nèi)徑100～300 μmol)，在室溫下平衡10 min，然后放于酶Ⅰ溶液中進(jìn)行消化，37℃恒溫水浴消化5～10 min后轉(zhuǎn)入酶Ⅱ繼續(xù)消化5～10 min。之后取出組織于室溫下于分離液Ⅱ中漂洗 2～3 次，輕柔吹打后鋪片，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道電流記錄 膜片鉗實(shí)驗(yàn)采用單通道內(nèi)面向外式記錄方式(inside-out recording)。選用厚壁有芯硼硅酸鹽玻璃微管(內(nèi)徑1.05 mm，壁厚0.45 mm)，用微電極拉制器兩步垂直拉制，電極經(jīng)拋光后尖端直徑為0.5～1 μm，在玻璃微電極的尾端充灌高鉀電極內(nèi)液后，入液阻值為15～20 MΩ。電流信號經(jīng)Axon 700B amplifier放大，采樣頻率10 kHz，八極Bessel低通濾波頻率為2 kHz，在Clampex10.0軟件控制下，進(jìn)行A/D、D/A轉(zhuǎn)換，采用pCLAMP10.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。

NPo-voltage (V)關(guān)系采用Boltzmann方程擬合：〔6〕

P0=1/{1+exp〔-ZF/RT(V-V1/2)〕}，

(1)

V1/2表示有半數(shù)通道激活的膜電位，F(xiàn)表示法拉第常數(shù)，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。

Ca2+依賴性激活曲線采用希爾方程擬合：〔7〕

P0=〔ca2+〕iηH/(KdηH+〔Ca2+〕iηH

(2)

其中ηH為希爾系數(shù)，Kd為解離常數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道電流和電導(dǎo) 在電極內(nèi)外液為對稱性高鉀(145 mmol/L)溶液，游離鈣〔Ca2+〕free濃度為0.3 μmol/L，從-60～+60 mV的電壓范圍內(nèi)，BKCa通道開放概率和電流幅值隨去極化電壓逐漸增加，呈電壓依賴性(圖1A)。電流-電壓曲線(I-V curve)呈良好的線性關(guān)系，無整流現(xiàn)象且反轉(zhuǎn)電位接近0(圖1B)。在鉗制電位(HP)為+40 mV時(shí)，BKCa通道開放概率隨〔Ca2+〕free濃度的增加而增加，具有鈣依賴性(圖1C)。這些特性均符合BKCa通道的生物物理特性。老年組與青年組的電導(dǎo)值無顯著性差異，青年組為(247.6±8.4)pS，老年組為(241.7±7.6)pS。

2.2衰老誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電壓依賴性和鈣敏感性下降 如圖2A所示，〔Ca2+〕free為1 μmol/L時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)化的開放概率(NPo)為縱坐標(biāo)，鉗制電壓為橫坐標(biāo)，做通道標(biāo)準(zhǔn)化總開放概率-電壓(Normalized NPo-V)關(guān)系曲線，并采用Boltzmann方程公式〔6〕進(jìn)行擬合。各組標(biāo)準(zhǔn)化NPo均隨電壓的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的電壓依賴性。與青年安靜組比較，老年組的此曲線沿著電壓軸右移，其V1/2值(使通道達(dá)50%最大Po的電壓值)分別是(61.29±2.44)mV(老年組)和(45.35±1.87)mV(青年組)。提示衰老可以使大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道電壓敏感性降低。

如圖2B所示，以膜電位+40 mV下記錄到的Normalized NPo為縱坐標(biāo)，不同胞內(nèi)〔Ca2+〕free為橫坐標(biāo)，做通道標(biāo)準(zhǔn)化總開放概率-鈣離子濃度 (NPo-Ca2+)關(guān)系曲線，并采用希爾方程公式〔7〕進(jìn)行擬合。各組標(biāo)準(zhǔn)化NPo均隨〔Ca2+〕free(0.1～100 μmol/L)的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的鈣離子敏感性。與青年組相比較，老年組此曲線右移，其Kd值(使通道達(dá)最50%大開放概率的胞內(nèi)鈣濃度)分別是(5.04 ± 0.50)μmol/L(老年組)和(1.34 ± 0.13)μmol/L(青年組)。此結(jié)果衰老可以使大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道鈣敏感性降低。

2.3衰老對大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道藥理學(xué)特性的影響 見圖3，〔Ca2+〕free=0.1 μmol/L，HP=+40 mV情況下，1 μmol/L Tamoxifen能增加各組BKCa通道的開放概率，使青年組增加(4.8±0.5)倍，而老年組增加僅(1.6±0.3)倍。提示衰老可使大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道β1亞基功能顯著下調(diào)，導(dǎo)致其電壓敏感性和鈣離子敏感性下降，從而使其活性下降。

2.4衰老對大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道門控特征的影響 HP=+40 mV條件下，兩年齡組BKCa通道在〔Ca2+〕free為1 μmol/L和3 μmol/L時(shí)的單通道電流圖(圖4)，可以看出青年組通道平均開放概率均顯著高于老年組；且通道平均開放時(shí)間(To)青年組長于老年組，而平均關(guān)閉時(shí)間(Tc)青年組短于老年組。

A:不同HP下，青年組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa的單通道電流;B:青年組BKCa通道電流-電壓曲線；C:BKCa通道鈣依賴性電流圖，HP=+40 mV；A和B中浴液游離鈣濃度(〔Ca2+〕free)為0.3 μmol/L；-C表示通道關(guān)閉

A:標(biāo)準(zhǔn)化NPo-V關(guān)系曲線;B:標(biāo)準(zhǔn)化NPo-log〔Ca2+〕free曲線

A和B分別為衰老和青年組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上BKCa通道在〔Ca2+〕free=1 μmol/L(A)和3 μmol/L(B)時(shí)的典型單通道電流圖(c表示通道處在關(guān)閉水平，o表示通道處于開放水平)；C為BKCa通道開放概率直方圖；D為通道開放與關(guān)閉時(shí)間直方圖；與青年組比較：1)P<0.01

圖3 衰老大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道藥理學(xué)特性的影響

3 討 論

近十年以來，國內(nèi)外學(xué)者〔3～11〕運(yùn)用膜片鉗技術(shù)、Westem印跡和離體血管環(huán)等技術(shù)證明了機(jī)體某些血管床上的BKCa通道隨著增齡其表達(dá)和功能減弱，而在另一些血管床上其表達(dá)和功能未發(fā)生變化。如Marijic等〔3〕報(bào)道衰老使F344大鼠及人類冠脈平滑肌細(xì)胞膜上的BKCa通道的α亞基表達(dá)下降，全細(xì)胞電流密度減小。Nishimaru 等〔4〕發(fā)現(xiàn)老齡F344大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)水平呈1∶1下調(diào)，而其功能特性未發(fā)生變化。Albarwani等〔9〕研究也表明衰老F344大鼠冠狀動(dòng)脈BKCa通道的全細(xì)胞電流密度和整個(gè)血管條對Iberiotoxin誘發(fā)的血管收縮反應(yīng)下降。另有報(bào)道，大鼠主動(dòng)脈〔10〕和人腸系膜動(dòng)脈〔11〕平滑肌細(xì)胞上的BKCa通道活性也降低。但衰老對大鼠肺動(dòng)脈〔3〕和腦動(dòng)脈〔5〕平滑肌BKCa通道蛋白的表達(dá)卻無影響。表明衰老對不同動(dòng)脈的BKCa通道蛋白的表達(dá)和功能的影響具有選擇性，而這種選擇性的具體機(jī)制仍不清楚。BKCa通道的電導(dǎo)值一般為100～300 pS，具有電壓依賴性和鈣敏感性〔12，13〕，本研究得到的BKCa通道基本特性符合此特點(diǎn)，但是老年組和青年組BKCa通道的電導(dǎo)值并無顯著性差異。表明衰老對腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的K+離子通透性無顯著影響。

動(dòng)脈平滑肌上的BKCa通道是由形成孔道的4個(gè)同源的α亞基和4個(gè)β1亞基組成的異源多聚體通道，其中每一個(gè)α亞基都擁有一個(gè)電壓感受器和鈣敏感性感受器，β1亞基可以增加BKCa通道的鈣敏感性和電壓敏感性，增加其開放時(shí)間并影響其對某些藥物的敏感性〔14〕。在本研究中，衰老大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的電壓敏感性、鈣敏感性都下降，且對Tamoxifen的敏感性也下降。吳愛山等〔11〕的研究顯示在衰老過程中，人腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa通道的鈣敏感性和電壓敏感性都下降、開放概率降低、關(guān)閉時(shí)間延長、開放時(shí)間縮短。同時(shí)，羅興林等〔10〕也發(fā)現(xiàn)衰老Wistar大鼠主動(dòng)脈BKCa通道的鈣敏感性和電壓敏感性下降、開放概率降低、關(guān)閉時(shí)間延長，這與本研究結(jié)果相似。然而Nishimarua等〔4，5〕采用巨膜片內(nèi)面向外記錄技術(shù)的研究表明衰老F344大鼠冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈BKCa通道電壓敏感性和鈣敏感性都未反生改變，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的BKCa通道α亞基和β1亞基表達(dá)呈1∶1下降，導(dǎo)致全細(xì)胞BKCa通道電流密度下降，而腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上BKCa通道α亞基和β1亞基表達(dá)都未下降，全細(xì)胞電流密度未變。

由于正常的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上BKCa通道由一定比例的α亞基和β1組成，因此改變這些亞基的組成比例可對其功能產(chǎn)生很大影響。β1亞基可以明顯增加BKCa通道的電壓敏感性和鈣敏感性〔15，16〕，增加對Tamoxifen〔8〕、雌激素和DHS-1的敏感性〔17〕。已有文獻(xiàn)證明把BKCa通道β1亞基基因敲除可使BKCa通道的鈣敏感性急劇下降、開放概率降低、對DHS-I的敏感性下降、與鈣火花失耦聯(lián)，從而導(dǎo)致血管張力增加，對血管收縮物質(zhì)敏感性增加，血壓升高〔5〕。因此，我們推測本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的衰老動(dòng)脈BKCa通道電壓敏感性和鈣敏感性下降很可能是由于β1亞基功能顯著下調(diào)導(dǎo)致的。Tamoxifen是一種雌激素受體拮抗劑，文獻(xiàn)報(bào)道其對BKCa通道的激動(dòng)作用需要β1亞基的存在〔8〕，因此它常被用作檢測β1亞基功能。本文結(jié)果顯示老年組對Tamoxifen的敏感性顯著低于青年組，提示衰老腸系膜動(dòng)脈平滑肌上的β1亞基功能確有顯著下降。雖然實(shí)驗(yàn)中未檢測兩種亞基的表達(dá)情況，但從功能角度可以明確衰老導(dǎo)致β1亞基功能下降較之α亞基更為顯著。

總之，衰老誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道功能下調(diào)，以β1亞基功能下調(diào)更顯著。

4 參考文獻(xiàn)

1Nelson MT，Quayle JM.Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，1995；268：C799-822.

2Brenner R，Peréz GJ，Bonev AD，etal.Vasoregulation by the beta1 subunit of the calcium-activated potassium channel〔J〕.Nature，2000；407：870-6.

3Marijic J，Li Q，Song M，etal.Decreased expression of voltage-and Ca2+-activated K+channels in coronary smooth muscle during aging〔J〕.Cirt Res，2001；88：210-6.

4Nishimaru K，Eghbali M，Rong L，etal.Functional and molecular evidence of MaxiK channel β1 subunit decrease with coronary artery ageing in the rat〔J〕.J Physiol，2004；559：849-62.

5Nishimaru K，Eghbali M，Stefani E，etal.Function and clustered expression of MaxiK channels in cerebral myocytes remain intact with aging〔J〕.Exp Gerontol，2004；39：831-9.

6Fleg JL，Strait J.Age-associated changes in cardiovascular structure and function：a fertile milieu for future disease〔J〕.Heart Fail Rev，2012；17：545-54.

7Lakatta EG，Levy D.Arterial and cardiac aging：major share holders in cardiovascular disease enterprises：part Ⅰ：aging arteries：a “set up” for vascular disease〔J〕.Circulation，2003；107：139-46.

8Dick GM，Rossow CF，Smirnov S，etal.Tamoxifen activates smooth muscle BK channels through the regulatory β1 subunit〔J〕.J Biol Chem，2001；276：34594-9.

9Albarwani S，Al-Siyabi S，Baomar H，etal.Exercise training attenuates ageing-induced BKCa channel down regulation in rat coronary arteries〔J〕.Exp Physiol，2010；95：746-55.

10羅興林，李秀琴，楊 燕.主動(dòng)脈平滑肌鈣激活鉀通道的增齡變化〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2005；5：545-8.

11吳愛山，羅興林，褚現(xiàn)明，等.人腸系膜動(dòng)脈平滑肌BKCa增齡變化的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006；26(2)：361-3.

12Barrett JN，Magleby KL，Pallotta BS.Properties of single calcium-activated potassium channels in cultured rat muscle〔J〕.J Physiol，1982；331：211-30.

13Pallotta BS，Magleby KL，Barrett JN.Single channel recordings of Ca2+-activated K+currents in rat muscle cell culture〔J〕.Nature，1981；293：471-4.

14Shi L，Zhao L，Zeng F，etal.Effect of exercise training volume on arterial contractility and BKCa channel activity in rat thoracic aorta smooth muscle cells〔J〕.Eur J Appl Physiol，2012；112：3667-78.

15Cox DH，Aldrich RW.Role of the β1 subunit in large conductance Ca2+-activated K+channel gating energetics：mechanisms of enhanced Ca2+sensitivity〔J〕.J Gen Physiol，2000；116：411-32.

16Bao L，Cox DH.Gating and ionic currents reveal how the BKCa channel’s Ca2+sensitivity is enhanced by its β1 subunit〔J〕.J Gen Physiol，2005；126：393-412.

17Valverde MA，Rojas P，Amigo J，etal.Acute activation of Maxi-K channels (hSlo) by estradiol binding to the β subunit〔J〕.Science，1999；285：1929-31.