雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬iNOS表達(dá)和突觸超微結(jié)構(gòu)的影響

胡小令 桂 婷 黃濤波 呂 誠(chéng) 李耀斌 薛國(guó)勇 溫 蔚 石嘉慶

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積引起的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)是阿爾茨海默病(AD)形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是炎癥中的一種反應(yīng)性酶類，其產(chǎn)生的大量一氧化氮(NO)是炎癥損傷的重要因子之一，與Aβ的神經(jīng)毒性密切相關(guān)〔1，2〕?？寡姿幬镌谥委烝D方面可能具有一定的作用。從衛(wèi)矛科植物雷公藤中分離出的雷公藤內(nèi)酯醇具有抗炎、免疫抑制作用。本實(shí)驗(yàn)探求雷公藤內(nèi)酯醇治療AD的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器 Aβ1～40(Sigma公司)；雷公藤內(nèi)酯醇(純度為99.8%，批號(hào)070929，福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，溶于4%丙二醇溶液中，經(jīng)200目過(guò)濾器濾過(guò)除菌后備用)；兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗體(Santa cruz公司)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(Zymed公司)；DAB染色試劑盒(北京中杉公司)；江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠)；電腦快速恒溫冷凍切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)；H-600透射電鏡(日立公司)。

1.2動(dòng)物分組與處理 用無(wú)菌生理鹽水將Aβ1～40稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變?yōu)槟蹜B(tài)的Aβ1～40。4月齡體質(zhì)量250～275 g的SD雄性大鼠由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。用Morris水迷宮初篩，去除先天癡呆和游泳姿勢(shì)不良者，隨機(jī)抽取7只合格大鼠，按照本課題組以往的模型制作法〔3〕給予左側(cè)海馬(以Bregma點(diǎn)為0點(diǎn)，AP-3.0 mm，ML 2.0 mm，DV-2.9 mm)一次性注射生理鹽水1 μl，設(shè)為對(duì)照組。其余合格大鼠給予左側(cè)海馬(注射部位同上)一次性注射凝聚態(tài)Aβ1～401 μl復(fù)制AD模型，在術(shù)后1 w進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以對(duì)照組大鼠逃避潛伏期均值的95%上限值為標(biāo)準(zhǔn)，將超出上限值者確定為癡呆大鼠。選出造模成功者隨機(jī)分為模型組和用藥組，每組7只。用藥組每日腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg，共15 d，對(duì)照組和模型組腹腔注射等容積4%丙二醇溶液。每組5只動(dòng)物用于免疫組化染色，2只用于電鏡觀察。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 藥物干預(yù)15 d后，每組各取5只動(dòng)物經(jīng)左心室插管，生理鹽水沖洗后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)300 ml灌注，取腦置于上述灌注液中后固定3 h，30%蔗糖浸泡至下沉，在大腦海馬注射區(qū)附近連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚25 μm，進(jìn)行iNOS免疫組織化學(xué)染色。iNOS免疫組織化學(xué)染色按SP免疫組織化學(xué)試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作，兔抗iNOS多克隆抗體(1∶100)，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察，著棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，重復(fù)上述步驟。每個(gè)動(dòng)物取3張切片,每張切片在注射區(qū)附近隨機(jī)取互不重疊的3個(gè)視野,在顯微鏡(×100)下采用Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)出iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度。

1.4電鏡觀察 藥物干預(yù)15 d后，每組各取2只動(dòng)物用含4%多聚甲醛·2.5%戊二醛的磷酸緩沖液經(jīng)左心室灌注固定，參照腦立體定位圖譜在每例大鼠的海馬區(qū)注射點(diǎn)附近取1個(gè)1 mm3的組織塊，入上述固定液再固定3～4 h，常規(guī)包埋、半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位后，再做成超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，H-600透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1iNOS免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠海馬iNOS陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度不同。模型組大鼠海馬iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，用藥組大鼠海馬iNOS陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度較模型組明顯減少(P<0.05)，但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯改變(表1，圖1)。

表1 各組大鼠海馬iNOS免疫組織化學(xué)染色結(jié)果±s,n=5)

圖1 各組大鼠海馬iNOS免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞(DAB，×100)

2.2電鏡突觸超微結(jié)構(gòu)的改變 透射電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)氈內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)清晰、數(shù)量較多，突觸前囊內(nèi)可見(jiàn)大量輪廓清晰、圓形透亮的突觸小泡，突觸后膜胞漿面可見(jiàn)電子密度高的突觸后致密物；模型組大鼠海馬神經(jīng)氈內(nèi)突觸和突觸小泡數(shù)量較對(duì)照組減少，突觸后致密物厚度變薄；用藥組大鼠海馬神經(jīng)氈內(nèi)突觸和突觸小泡數(shù)量較模型組增多，突觸后致密物增厚(圖2)。

圖2 大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)

3 討 論

突觸是神經(jīng)傳輸、加工的樞紐，是受體、通道、功能蛋白的密集之地。突觸可塑性是神經(jīng)可塑性的最主要形式。大量研究表明，學(xué)習(xí)記憶能力與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸結(jié)構(gòu)可塑性密切相關(guān)。突觸結(jié)構(gòu)可塑性主要表現(xiàn)在神經(jīng)元突觸數(shù)量、形態(tài)、神經(jīng)環(huán)路等方面的變化〔11〕。Scheff等〔12〕發(fā)現(xiàn)，AD患者海馬齒狀回突觸明顯丟失。Alonso-Nanclares等〔13〕的研究顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬齒狀回突觸數(shù)量明顯下降。Li等〔14〕發(fā)現(xiàn)，快速老化模型小鼠海馬CA1區(qū)突觸密度、表面積密度和突觸后致密物厚度明顯減少。趙唯賢等〔15〕發(fā)現(xiàn)模型組海馬CA1區(qū)突觸密度降低，突觸間隙變小，突觸小泡數(shù)量減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述文獻(xiàn)均提示AD腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)受損，但其病理機(jī)制尚未完全明了。研究表明，Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、NO、超氧化物等炎性介質(zhì)，使Tau蛋白磷酸化，引起細(xì)胞骨架重組，阻礙正常微管聚集和軸突穩(wěn)定，導(dǎo)致突觸蛋白和突觸丟失〔16〕；AD腦內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)突觸和樹(shù)突棘的丟失〔17〕；AD腦內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)可抑制突觸傳遞可塑性的重要指標(biāo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)〔18〕。因此，我們認(rèn)為AD突觸結(jié)構(gòu)受損可能與其腦內(nèi)的慢性免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

雷公藤內(nèi)酯醇是從雷公藤中提取出來(lái)的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制作用，在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎臟疾病等自身免疫性炎癥性疾病方面已經(jīng)取得了較好療效〔19〕。由于AD腦內(nèi)的免疫炎癥病理，雷公藤內(nèi)酯醇有可能通過(guò)抗炎、免疫抑制機(jī)制對(duì)AD進(jìn)行干預(yù)。雷德亮等〔20〕發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇能抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬內(nèi)Aβ沉積和老年斑形成。顧明等〔21〕發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)Aβ1～42所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有抑制作用。陳龍飛等〔10〕發(fā)現(xiàn)雷公藤氯內(nèi)酯醇(雷公藤內(nèi)酯醇的衍生物)可以抑制Aβ1～40誘導(dǎo)的iNOS 表達(dá)和NO 產(chǎn)生。我們的前期工作表明，雷公藤內(nèi)酯醇可以改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制AD模型大鼠海馬NF-κB的活化〔3〕，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔22〕。結(jié)合上述文獻(xiàn)資料，我們認(rèn)為，雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)AD具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，這種神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制AD腦內(nèi)的慢性免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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