益氣溫陽活血方含藥血清對大鼠肥大心肌細(xì)胞原癌基因c-fos、c-myc表達(dá)的影響

李春陵 顧廣富 羅建華 楊冬花

(貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 50002)

持續(xù)的交感神經(jīng)過度激活是慢性心力衰竭的重要特征，也是心室重塑和病情惡化的重要促進(jìn)因子〔1〕。c-fos、c-myc是調(diào)控細(xì)胞增殖的相關(guān)原癌基因，通過調(diào)控肥大晚期基因的表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，蛋白表型向胚胎型轉(zhuǎn)化〔2〕。益氣溫陽活血方在心力衰竭早期可通過PPARγ信號通路調(diào)節(jié)血管緊張素(Ang)Ⅱ、醛固酮的表達(dá)，防止心室重塑，改善心臟功能〔3〕，但是否能通過抑制c-fos、c-myc的表達(dá)防止心室重塑，目前尚不清楚。本研究益氣溫陽活血方對肥大心肌細(xì)胞c-fos、c-myc表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康Wistar大鼠30只，體重(250±10)g，雌雄各半；Wistar乳鼠40只，新生2 d左右，雌雄不拘，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。

1.2益氣溫陽活血方組成 人參30 g，黃芪30 g，桂枝9 g，丹參30 g，益母草30 g，紅花6 g，白術(shù)15 g，澤瀉9 g，茯苓15 g，葶藶子9 g，炙甘草6 g等11味中藥，藥材從貴州省人民醫(yī)院中藥房一次性選購，生藥按比例取好，加水浸泡1 h，第1遍煮沸40 min，濾渣取汁，再加水煮沸15 min，濾渣取汁，合并2次煎液，在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4 g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑 卡維地洛(齊魯制藥有限公司，批號：H20000100)，胎牛血清(GIBCO公司)，AngⅡ(Sigma公司)，1640培養(yǎng)基、胰酶(Sigma公司)，大鼠Anti-c-fos抗體、大鼠Anti-c-myc抗體(Santa Cruz公司)，ECL顯影試劑盒(Santa Cruz 公司)，AD、NE(IBL公司)，制膠、電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

1.4含藥血清制備 大鼠分為中藥組10只，予益氣溫陽活血方(8 ml/kg)灌胃治療；卡維地洛組10只，予卡維地洛(50 mg·kg-1·8 ml-1蒸餾水)灌胃治療；空白血清組10只，予蒸餾水(8 ml/kg)灌胃。均每日給藥2次，共8 w。末次灌胃后1 h頸動脈采血處死動物，分離血清。將血清經(jīng)微孔濾膜滅活、濾菌后與DMEM培養(yǎng)基配成10%濃度。

1.5肥大心肌細(xì)胞模型 取新生乳鼠心室肌，用0.25%胰蛋白酶消化分離，經(jīng)差速純化2 h，將接種于10%血清DMEM培養(yǎng)液中。取上述細(xì)胞加入AngⅡ(終濃度10-7mol/L)作用48 h誘導(dǎo)心肌肥大。

1.6實驗分組及處理 正常組正常心肌細(xì)胞加空白血清培養(yǎng)。模型組肥大心肌細(xì)胞加空白血清培養(yǎng)。中藥組和西藥組肥大心肌細(xì)胞加益氣溫陽活血方、卡維地洛含藥血清培養(yǎng)。

1.7心肌細(xì)胞蛋白含量測定 吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液，用D-Hanks 液快速沖洗3次后，加入1% SDS 0.5 ml溶解細(xì)胞，根據(jù)計數(shù)，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個，Lowrys 法測每孔細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

1.8心肌細(xì)胞體積測量 用D-Hanks液快速沖洗長滿細(xì)胞的培養(yǎng)孔3次，每孔加0.3 ml 0.1%的胰蛋白酶，放入37℃恒溫箱中30 min后，再加入0.2 ml含有10%血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞注入一細(xì)胞室內(nèi)，在400倍的倒置顯微鏡下觀察其中的細(xì)胞。用計算機(jī)CIAS大恒細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細(xì)胞直徑，計算細(xì)胞的體積。每孔隨機(jī)選擇4個視野，每個視野測20個細(xì)胞。

1.9檢測細(xì)胞上清AD、NE含量 以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測，操作過程參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.10肥大心肌c-fos、c-myc蛋白質(zhì)的表達(dá) 提取心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛染鶠?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，化學(xué)發(fā)光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描并分析。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

模型組心肌細(xì)胞蛋白含量、心肌細(xì)胞體積及細(xì)胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質(zhì)表達(dá)水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P<0.05)。中藥組、西藥組心肌細(xì)胞蛋白含量、心肌細(xì)胞體積及細(xì)胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質(zhì)表達(dá)水平與正常組均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。心肌細(xì)胞c-fos、c-myc蛋白質(zhì)表達(dá)水平的聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)電泳圖見圖1。

表1 各組心肌細(xì)胞蛋白含量、心肌細(xì)胞體積及細(xì)胞上清AD、NE含量、c-fos、c-myc蛋白質(zhì)表達(dá)水平±s,n=10)

圖1 c-fos和c-myc蛋白質(zhì)的表達(dá)

3 討 論

目前，由AngⅡ誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞肥大模型是常用的實驗?zāi)Ｐ停茄芯啃氖抑厮馨l(fā)生機(jī)制的理想方法，也是篩選和評價抗心肌肥大新藥的常用方法之一。心肌肥大主要是指心肌細(xì)胞體積增大、重量增加而無細(xì)胞分裂，表現(xiàn)為：心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)蓄積、肌原纖維新形成的肌節(jié)增加〔4〕，本研究結(jié)果顯示：由AngⅡ誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細(xì)胞的蛋白含量、體積明顯高于正常心肌細(xì)胞。

c-fos、c-myc是調(diào)控細(xì)胞增殖的相關(guān)原癌基因，其編碼的核蛋白作為反式作用因子，通過激活某些基因的轉(zhuǎn)錄而參與細(xì)胞增殖信號的傳遞，可調(diào)控影響細(xì)胞生長、分化基因的表達(dá)〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，將AngⅡ加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，心肌細(xì)胞原癌基因c-fos表達(dá)迅速加強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成速率明顯增加，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大〔6〕。在充血性心力衰竭中，由于c-myc的過表達(dá)，可導(dǎo)致一些心肌肥大信號通路的活化，從而出現(xiàn)心臟功能失調(diào)、心肌壞死〔7〕。

交感神經(jīng)系統(tǒng)激活是慢性心力衰竭最快速最早期的代償機(jī)制之一。在心力衰竭早期，兒茶酚胺濃度明顯升高，NE釋放，作用于β腎上腺受體，提高心肌收縮力、心率，從而增加心排血量〔1〕。但長時間交感神經(jīng)系統(tǒng)的高度激活對心臟本身和心功能均產(chǎn)生不利影響，可增加心肌耗氧量，特別是NE對心肌細(xì)胞有直接的毒性作用，促使心肌細(xì)胞凋亡，參與心室重塑的病理過程〔8〕。慢性心力衰竭時β腎上腺受體的激活程度決定了心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展。研究表明，在心力衰竭心肌中，β3腎上腺受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，且表達(dá)持續(xù)升高，隨著心力衰竭加重，β3腎上腺受體的表達(dá)與左心室功能高度相關(guān)〔9，10〕。

導(dǎo)致心肌肥大可分3個環(huán)節(jié)：胞外肥大刺激信號、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生肥大表型變化〔11〕。Ca2+是心肌細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使，心力衰竭時β3腎上腺受體興奮，使靜息心肌細(xì)胞〔Ca2+〕i升高〔12〕，活化鈣調(diào)磷酸神經(jīng)激酶-活化的T細(xì)胞核因子3信號通路，激活第三信使c-myc、c-fos等原癌基因〔13〕，作用于次級反應(yīng)基因心房利鈉因子、AngⅡ等〔14，15〕，使心肌細(xì)胞向胚胎化發(fā)展，引起心肌蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞體積增加，心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原合成和分泌。

交感神經(jīng)系統(tǒng)激活β受體介導(dǎo)的心室重塑是心力衰竭發(fā)生與發(fā)展的主要病理生理機(jī)制，也構(gòu)成了β受體阻滯劑治療慢性心力衰竭的基石作用。近年來，眾多臨床試驗已經(jīng)證實了β受體阻滯劑對于心力衰竭的治療作用，主要通過對交感神經(jīng)激活的抑制，來改善患者心室重塑和心功能。具有與β受體阻滯劑——卡維地洛相同的作用。推測該方防止心肌肥大的機(jī)制，可能是通過對交感神經(jīng)興奮的抑制，阻斷β3腎上腺受體持續(xù)激活，抑制鈣調(diào)磷酸神經(jīng)激酶-活化的T細(xì)胞核因子3信號通路的活化，減少核內(nèi)c-myc、c-fos等原癌基因的激活表達(dá)，從而阻斷心肌肥大信號對下游的傳遞，避免心肌細(xì)胞向胚胎化發(fā)展而實現(xiàn)的。具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1劉曉莉，肖培林，殷躍輝.經(jīng)導(dǎo)管消融選擇性去腎交感神經(jīng)治療——未來心力衰竭治療的熱點〔J〕.心血管病學(xué)進(jìn)展，2013；34(3)：378-81.

2江鳳林，馮 俊，鄭 智.丹參酮ⅡA對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中c-fos、c-myc和c-jun mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2007；23(1)：55-9.

3楊冬花，付 蓉，羅建華，等.益氣溫陽活血方對早期心力衰竭大鼠血管緊張素Ⅱ和醛固酮的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(7)：2472-4.

4楊光宇，王洪新，趙素玲，等.黃芪甲苷對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2013；29(3)：28-31.

5文婷婷，陳 萍.原癌基因致急性心肌梗死后心室重構(gòu)的研究進(jìn)展〔J〕.國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2010；31(3)：248-57.

6周代星，梁黔生，何雪心，等.AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中c-fos，c-jun mRNA表達(dá)變化及丹參酮ⅡA 的影響〔J〕.中國中藥雜志，2008；33(8)：936-9.

7Chen HB，Wang L，Jiang JF.Re-analysis of expression profiles for revealing new potential candidate genes of heart failure〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013；17(7)：903-11.

8葛均波，徐永建.內(nèi)科學(xué)〔M〕.第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：165.

9冷曉寧，賈 靜，王蕾紅，等.心衰大鼠心肌β3腎上腺素能受體和內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012；46(2)：99-103.

10陳 哲，安慧玲，陳枚潔，等.心力衰竭大鼠增齡過程中β3腎上腺素能受體異常表達(dá)的研究〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志( 電子版)，2013；7(7)：3019-23.

11王桂君，郭蓮怡，王洪新.鈣離子在腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)心肌肥大中的作用〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013；21(1)：47-51.

12鄧義軍，伍 衛(wèi)，方 昶，等.β3-腎上腺素能受體對心力衰竭大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的調(diào)控及其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009；29(8)：1635-40.

13楊永健，張 鑫，速曉華.β腎上腺素受體信號相關(guān)通路參與心功能不全患者心肌重構(gòu)的機(jī)制〔J〕.心臟雜志，2008；20(1)：37-44.

14趙育潔，秦志平，劉宗芳.培哚普利對急性心肌梗死后大鼠心肌組織中AngⅡ、ERK1/2、c-fos mRNA含量的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版 )，2008；43(1)：146-9.

15劉軍翔，宋冬林，張方寧.復(fù)合離子鹽對兩腎一夾高血壓大鼠左心室心肌肥厚和纖維化的影響及其機(jī)制的初步探討〔J〕.臨床薈萃，2011；26(7)：597-601.