瑞芬太尼對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

楊劍云 吳 婭 臧 暉 李翠林 金 華

(昆明市婦幼保健院麻醉科，云南 昆明 650031)

瑞芬太尼是一種新型的μ阿片受體激動(dòng)劑，因其藥效強(qiáng)，起效快，安全可靠，被廣泛應(yīng)用于圍術(shù)期患者的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和術(shù)后止痛。近年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，瑞芬太尼對(duì)全腦和局灶性的缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用〔1，2〕。瑞芬太尼能通過(guò)抵抗腦缺血再灌注損傷所致的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，但瑞芬太尼能否通過(guò)影響腦缺血再灌注后的炎癥應(yīng)答過(guò)程而起到腦保護(hù)作用，目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察瑞芬太尼對(duì)小鼠腦缺血再灌注后白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB表達(dá)變化的影響，以探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 瑞芬太尼購(gòu)于湖北宜昌人福藥業(yè)公司(批號(hào)：090910)；MCAO栓線購(gòu)于北京沙東生物技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；NF-κB p65和Lamin B抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。其余藥品和試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 雄性C57BL/6小鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和瑞芬太尼預(yù)處理組，每組24只。各組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)又分為缺血2 h后再灌注0 h、6 h、12 h、24 h組，每組6只。腦缺血再灌注損傷模型制作之前，瑞芬太尼預(yù)處理組通過(guò)靜脈輸入瑞芬太尼，每次輸注5 min，連續(xù)3次，輸注速率為0.7 μg·kg-1·min-1，容積1 ml/5 min,預(yù)處理過(guò)程共30 min。模型組小鼠接受生理鹽水灌注，速率、容積及方案與瑞芬太尼預(yù)處理組相同，假手術(shù)組不進(jìn)行腦缺血再灌注損傷，其余過(guò)程與模型組相同。

1.3動(dòng)物模型的制作 本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞模型，術(shù)中以肛溫計(jì)監(jiān)測(cè)體溫，并用白熾燈加熱維持肛溫在36 ℃～37 ℃。根據(jù)Longa線栓法加以改進(jìn)〔3〕。采用直徑0.32的栓線，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈后，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一切口，從中把栓線送入大腦中動(dòng)脈起始處，固定栓線，2 h后抽出栓線制備再灌注損傷模型。假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不閉塞大腦中動(dòng)脈。

1.4神經(jīng)功能缺損評(píng)分 腦缺血再灌注24 h后，采用Longa評(píng)分法對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分〔3〕。該評(píng)分法分為5個(gè)等級(jí)：0分，正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時(shí)，向?qū)?cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.5梗死體積的計(jì)算 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭、取腦，將腦組織置于-20 ℃中冷凍20 min后，置于腦切片模具內(nèi)，從額極開始由前向后間隔2 mm冠狀切取腦組織，置于37 ℃的2%TTC溶液中染色30 min。腦切片排序、拍照并輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)對(duì)切片梗死體積和全腦梗死體積計(jì)算，各樣本以腦梗死體積/全腦體積比作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6腦組織IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1的檢測(cè) 小鼠腦缺血再灌注0 h、6 h、12 h和24 h后，斷頭開顱取腦，分離缺血側(cè)大腦皮層組織。將皮層組織用4 ℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液,采用ELISA法用于IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1含量的檢測(cè)，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(博士德生物工程有限公司，武漢)的要求進(jìn)行。

1.7蛋白免疫印跡 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭開顱取鬧，分離缺血側(cè)大腦皮層組織。采用核蛋白與胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)制備核蛋白提取液，用于NF-κB活性的檢測(cè)。具體過(guò)程如下：BCA法行蛋白定量分析；配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜中；用10%的脫脂奶4℃封閉過(guò)夜。然后分別加入NF-κB p65(1∶500)和Lamin B(1∶1 000)的一抗封閉1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的IgG抗體，于室溫輕搖1 h雜交反應(yīng)，TTBS洗膜6次，每次5 min；加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min后保鮮膜包裹，暗室內(nèi)進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1瑞芬太尼改善腦缺血再灌注損傷所致的神經(jīng)功能障礙 與假手術(shù)組(0分)比較，腦缺血再灌注24 h后，模型組〔(3.10±0.45)分〕小鼠的神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重(P>0.05)；瑞芬太尼預(yù)處理組〔(2.71±0.44)分〕可以顯著地改善腦缺血再灌注損傷所致的神經(jīng)功能障礙(P<0.05)。

2.2瑞芬太尼減少腦梗死灶體積 與假手術(shù)組(0)相比，腦缺血再灌注24 h后，模型組(30.9%±1.8%)小鼠梗死灶體積顯著地增加(P<0.05)；而與模型組比較，瑞芬太尼預(yù)處理組(19.8%±2.0%)可以顯著地縮小腦缺血再灌注所致的梗死灶體積(P<0.05)。

2.3瑞芬太尼阻止NF-κB的活化 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦缺血再灌注24 h后，NF-κB的活性增強(qiáng)。而瑞芬太尼預(yù)處理組可以抑制NF-κB的活性。見圖1。

圖1 瑞芬太尼對(duì)缺血側(cè)皮層組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB水平的影響

2.4瑞芬太尼降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá) 模型組小鼠在腦缺血再灌注0 h和6 h后，缺血側(cè)皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；在腦缺血再灌注12 h后，IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平開始下降。而與模型相比，瑞芬太尼預(yù)處理組可以顯著減低缺血側(cè)皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血側(cè)皮層組織不同時(shí)刻IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β±s,n=6,pg/mg)

2.5瑞芬太尼增加抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá) 模型組小鼠在腦缺血再灌注0、6、12和24 h后，缺血側(cè)皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達(dá)水平顯著增加，并都在6 h達(dá)到最高水平。與模型組相比，瑞芬太尼預(yù)處理組可以顯著增加缺血側(cè)皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達(dá)水平(P<0.05)。見表1。

3 討 論

阿片受體是一種G蛋白耦聯(lián)受體，其在人體內(nèi)廣泛存在，具有多種生物學(xué)活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，阿片受體具有腦保護(hù)作用，能抵抗臟器缺血再灌注損傷〔4～6〕。阿片受體主要有四種類型：δ、μ、κ和孤啡肽受體。近年研究發(fā)現(xiàn)，μ型阿片受體具有抗炎癥作用〔7〕。瑞芬太尼作為一種新型的μ阿片受體激動(dòng)劑，廣泛用于臨床的麻醉。已有研究結(jié)果表明，瑞芬太尼對(duì)腦缺血再灌注損傷具有抵抗作用。但對(duì)其保護(hù)機(jī)制目前還不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，瑞芬太尼能通過(guò)抵抗炎癥反應(yīng)改善小鼠腦缺血再灌注損傷所致的行為障礙，減少腦梗死體積。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要原因之一〔8〕。腦缺血時(shí)血液炎癥細(xì)胞會(huì)向腦內(nèi)浸潤(rùn)，膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活，引發(fā)腦組織炎癥反應(yīng)的失控，加重腦缺血再灌注損傷〔9〕。細(xì)胞因子在腦缺血的炎癥應(yīng)答過(guò)程中扮演著十分重要的作用。腦缺血會(huì)導(dǎo)致IL-1β和TNF-α等促炎癥因子的表達(dá)上調(diào)〔9～11〕。在短暫性局部腦缺血模型中IL-1β和TNF-α的表達(dá)被上調(diào)，并在再灌注數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到頂峰。IL-1β和TNF-α對(duì)腦缺血時(shí)嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞的激活起著十分關(guān)鍵的作用，IL-1β或TNF-α的抑制劑可以緩解腦缺血損傷〔12，13〕。腦缺血后炎癥應(yīng)答過(guò)程所致的損傷程度主要取決于促炎癥因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和抗炎癥因子的誘導(dǎo)作用?？寡装Y因子IL-10和 TGF-β1對(duì)緩解腦缺血再灌注損傷具有重要的調(diào)控作用，外源性IL-10和 TGF-β1的給予可以抵抗腦缺血再灌注損傷〔14～17〕。研究證實(shí)，IL-10能抑制促炎癥因子的產(chǎn)生〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中，瑞芬太尼能顯著地上調(diào)抗炎癥因子IL-10和 TGF-β1的表達(dá)，并抑制促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，推測(cè)瑞芬太尼可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)過(guò)程，阻止嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而起到腦保護(hù)作用。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中。NF-κB的激活可以誘導(dǎo)多種促炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合成復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。在應(yīng)激條件下，NF-κB被激活，進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)。許多研究證實(shí)，腦缺血會(huì)導(dǎo)致NF-κB的活化，誘導(dǎo)多種促炎癥因子的表達(dá)，如IL-1β和TNF-α〔19，20〕。在本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血再灌注時(shí)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的含量顯著地增加，NF-κB被活化。這一結(jié)果與腦缺血再灌注所致IL-1β和TNF-α的上調(diào)具有同向變化趨勢(shì)。而瑞芬太尼能顯著得抑制NF-κB的活化。這些研究結(jié)果表明，瑞芬太尼可能通過(guò)抑制NF-κB的活化，下調(diào)促炎癥因IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上，瑞芬太尼對(duì)腦缺血再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，可能通過(guò)降低促炎癥因子的表達(dá)，增加抗炎癥因子的表達(dá)，抑制NF-κB的活化，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。為瑞芬太尼應(yīng)用于腦缺血性卒中的治療及圍術(shù)期發(fā)生腦缺血缺氧的高危患者的安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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