腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β在淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)元損傷中的作用

邢恩鴻 田建麗 王愛霞 王瑞婷

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

淀粉樣蛋白(Aβ)作為阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的始動(dòng)因子已得到認(rèn)可。炎癥反應(yīng)在AD中的作用越來越受到關(guān)注。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用非甾體抗炎藥(NSAIDs)的老年人AD發(fā)生率明顯降低。Leuchtenberger等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)，給予NSAIDs后AD模型動(dòng)物腦內(nèi)Aβ沉積和活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量均明顯減少，腦內(nèi)炎性反應(yīng)明顯減輕。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ制作癡呆模型，采用免疫組化、ELISA等技術(shù)探討炎癥因子、膠質(zhì)細(xì)胞在AD發(fā)生中的作用，為抗炎藥物用于AD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 雄性Wistar大鼠20只，10～12 w,體質(zhì)量(280±20)g,動(dòng)物證號(hào)712123，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)。分籠飼養(yǎng)，每籠5只動(dòng)物室溫度(22±2)℃，自然光線，自由食水，普通飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，各10只，對(duì)照組大鼠海馬注射生理鹽水，模型組大鼠雙側(cè)海馬各注射Aβ 5 μl含10 μg,注射7 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)6 d，于第14天，處死，取血、腦組織。

1.2試劑 Aβ25～35購(gòu)自Sigma公司，HPLC≥97%，1 mg溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L),-20℃保存，臨用前置于37℃孵育7 d成凝膠態(tài)。大鼠血清TNF-α(RRA00)，IL-1β(RTA00)ELISA試劑盒由R&D提供,山羊抗兔GFAP 多抗(G9269)購(gòu)自中杉公司，其他試劑為分析純。

1.3癡呆動(dòng)物模型制作 4%的水合氯醛腹腔麻醉(1 ml/100 g)大鼠，固定于大鼠腦立體定位儀，于大鼠AP -3.5 mm，ML ±2 mm，DV 2.7 mm定位海馬CA1區(qū)，微量注射器10 min內(nèi)緩慢注入Aβ。

1.4Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 圓形不銹鋼水池，直徑120 cm,高60 cm，將水池等分為4個(gè)象限，目標(biāo)象限的中央放置一直徑為10 cm，高23.5 cm的圓形隱藏平臺(tái)，每天將大鼠從4個(gè)象限點(diǎn)面向池壁各測(cè)驗(yàn)2次，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間，如果動(dòng)物在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，潛伏期記為60 s。第1～2天為訓(xùn)練，后4 d數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)。

1.5血清制備 每組取6只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟取血，室溫放置30 min，于4℃，4 000 r/min離心10 min,取上清，凍存于低溫冰箱。血清TNF-α、IL-1β檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6光鏡標(biāo)本制作 每組選4只大鼠腦組織制作光鏡標(biāo)本。動(dòng)物麻醉取血后，經(jīng)左心室快速灌注250 ml的生理鹽水，然后灌注含4%多聚甲醛的PB液250 ml進(jìn)行內(nèi)固定，1 h后取腦，在海馬注射部位沿冠狀面切開，在4%多聚甲醛中外固定過夜，PBS液沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，冠狀面連續(xù)切片，片厚5 μm，切片取含海馬部位，做硫堇染色和免疫組化研究。

1.7硫堇染尼氏體 切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，蒸餾水沖洗，0.2%硫堇60℃水浴30～60 min，冷卻后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.8免疫組化 用處理過的載玻片撈片，(75±5)℃烤片40 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，PBS洗，95℃水浴抗原修復(fù)10～15 min，PBS沖洗，3%甲醇-H2O2去除過氧化物，PBS洗，10%山羊血清封閉37℃ 15 min，滴加Ⅰ抗(GFAP1∶80)孵育37℃ 2.5 h，PBS洗，Ⅱ抗孵育37℃ 15 min，PBS洗，Ⅲ抗孵育37℃ 15 min，DAB顯色，終止顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用PBS液代替一抗為陰性對(duì)照。

1.9細(xì)胞計(jì)數(shù) 每組選取2個(gè)標(biāo)本，光鏡下每個(gè)標(biāo)本選海馬CA1區(qū)細(xì)胞損傷最嚴(yán)重的連續(xù)4張切片，400倍視野下計(jì)數(shù)CA1區(qū)損傷段的細(xì)胞數(shù)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Aβ對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 對(duì)照組大鼠第3、4、5、6天尋找平臺(tái)潛伏期呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)，模型組大鼠尋找平臺(tái)潛伏期也呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)，但潛伏期與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)(P<0.01，見表1)。

表1 Aβ對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響±s,s)

2.2Aβ對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響 對(duì)照組海馬CA1區(qū)有3～4層細(xì)胞，排列整齊、形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)完整，尼氏體呈紫色，核不著色，核仁清晰，居中，可見大量樹突；模型組大鼠海馬CA1區(qū)僅有1～2層細(xì)胞，排列不規(guī)整，局部出現(xiàn)大段神經(jīng)元缺失、神經(jīng)元缺失部分有大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)異常，結(jié)構(gòu)不完成，部分樹突斷裂。模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0.01，見圖1，表2)。

2.3GFAP免疫組化染色結(jié)果 GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞特異性分泌的一種酸性蛋白，鏡下可見膠質(zhì)細(xì)胞突起呈棕黃色(圖2)，模型組海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(見表2)。

A:對(duì)照組(×40);B:模型組(×100);C:對(duì)照組(×400);D:模型組(×400)

組別尼區(qū)染色GFAP陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照組151.25±20.096.5±2.4模型組60.88±9.231)16.7±4.21)

對(duì)照組 模型組

2.4大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 模型組大鼠血清中TNF-α明顯高于對(duì)照組〔(86.72±25.37)pg/ml，P<0.05〕；大鼠血清中IL-1β〔(13.21±3.56)pg/ml〕明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討 論

體外凝聚態(tài)Aβ與AD患者腦中的Aβ有相似的結(jié)構(gòu)，其中25～35位氨基酸序列的多肽片段是Aβ的生物活性片段〔2〕，有報(bào)道Aβ25～35體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究顯示能引起海馬神經(jīng)元損傷、學(xué)習(xí)、記憶能力下降〔3，4〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示膠質(zhì)細(xì)胞參與了Aβ引起的神經(jīng)元損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道膠質(zhì)細(xì)胞可被Aβ激活，吞噬清除過多的Aβ，在中樞免疫過程是主要介體，其激活是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。GFAP在膠質(zhì)細(xì)胞激活中表達(dá)增加，最后成為膠質(zhì)疤痕的主要成分。GFAP特異性的存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast),研究發(fā)現(xiàn)GFAP的表達(dá)與Ast的活性成正比，GFAP表達(dá)增強(qiáng)標(biāo)志中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害時(shí)反應(yīng)性Ast增生〔5，6〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Aβ神經(jīng)毒性作用通過Aβ激活膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，參與神經(jīng)元損傷，促進(jìn)Aβ沉積，加速病程的發(fā)展。AD患者腦內(nèi)細(xì)胞因子水平持續(xù)增高,主要由處于持續(xù)激活狀態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等)產(chǎn)生，主要包括TNF-α、IL-1β等的表達(dá)增加〔7〕。徐書雯等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C1q可能通過促炎性因子TNF-α增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)MG炎癥反應(yīng)。鄔烈銘等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度可能是反映癡呆嚴(yán)重程度的狀態(tài)指標(biāo)。高濃度TNF-α對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用，Takeuchi等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)神經(jīng)毒性是通過激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)自分泌谷氨酸鹽實(shí)現(xiàn)的。TNF-α與神經(jīng)元膜上的受體TNF-R結(jié)合，而TNF-R與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體具有同源性，能激活相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，引起TNF-α與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的相互競(jìng)爭(zhēng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。TNF-α可協(xié)同IL-1強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生，加速Aβ沉積。有研究發(fā)現(xiàn)在AD患者腦中，IL-1β濃度增高與MG活化密切相關(guān)，MG在Aβ作用下可分泌大量的IL-1β〔11〕。IL-1β的過度表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔12〕，促進(jìn)Aβ沉積，加速AD的惡化。宴燕等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清TNF-α、IL-1β顯著高于正常對(duì)照組，TNF-α、IL-1β水平的檢測(cè)可以成為臨床輔助診斷的生物學(xué)指標(biāo)。最近有研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦可以抑制炎癥反應(yīng)，降低腦脊液內(nèi)致炎細(xì)胞因子水平，減少對(duì)神經(jīng)元的損害，改善認(rèn)知功能〔14〕。

慢性激活狀態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子在AD發(fā)病的不同環(huán)節(jié)主要起放大炎癥過程和細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞因子可興奮神經(jīng)元，抑制膽堿能神經(jīng)元傳遞，通過慢性局部炎癥導(dǎo)致選擇性腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元的變性死亡。因此，AD患者通過抗炎藥物抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的不適當(dāng)激活，減少腦內(nèi)細(xì)胞因子的量，可能延緩病程的發(fā)展。

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