不同時(shí)間點(diǎn)腦出血大鼠腦組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α和線粒體細(xì)胞色素C的表達(dá)

殷旭華 李冬梅 于慧玲

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

腦出血是發(fā)病率和致死率極高的腦血管疾病之一〔1〕。腦出血后輕微腦缺血伴隨著大量激活的細(xì)胞因子外滲及血腫周圍神經(jīng)元死亡，是腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要途徑之一〔2〕。因此如何阻斷腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和線粒體細(xì)胞色素(Cyt)-C在腦出血大鼠腦組織中的表達(dá)及與腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的Wistar老年雄性大鼠(20月齡)120只(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2007-吉大-0003)，體重(370±20)g。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 HIF-1α、Cyt-C的ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司；Trizol、HIF-1α和Cyt-C的引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于Takara生物有限公司。Biotek Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)ABI7300，美國(guó))；Biometra PCR擴(kuò)增儀(美國(guó))；腦立體定位儀(NARISH IGE SN-3型)。

1.3腦出血模型制備〔3〕采用自體尾動(dòng)脈血尾狀核定位注入法建立腦出血模型。動(dòng)物稱重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)。麻醉成功后，固定大鼠，在腦立體定位儀引導(dǎo)下用微量進(jìn)樣器向尾狀核(以前囟為原點(diǎn)R 3.0 mm，A 0.2 mm，H 5.0 mm)注入自體不加抗凝劑的尾動(dòng)脈血50 μl。假手術(shù)組:尾狀核部位打孔進(jìn)針、不注血，其他同模型制備。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為假手術(shù)組和腦出血模型組各60只；兩組按時(shí)間點(diǎn)分組：12、24、48、72 h、5和7 d組(n=10)。

1.5大鼠腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6大鼠腦組織中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的檢測(cè) 取冷凍腦組織60～100 mg，用Trizol提取總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定HIF-1α、Cyt-C mRNA的表達(dá)。根據(jù)Takara試劑盒說(shuō)明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：GAPDH(252 bp)上游5′-GACAGCAACAGGGTGGACG-3′，下游5′-GTTTGAGGGTGCAGCGAACTTG-3′；HIF-1α(198 bp)上游5′-TCAAGTCAGCAACGTGGAAG-3′，下游5′-TATCGAGGCTGTGTCGACTG-3′；Cyt-C(110 bp)上游5′-GTTGGACAGCCCCGATGTTAG-3′，下游5′-TTGAGAAAGGGAAAGGCAGTGATG-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組比較，腦出血模型組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.001)，72 h達(dá)高峰，隨后逐漸下調(diào)。腦出血模型組術(shù)后12、24、48 h、5、7 d與72 h HIF-1α、Cyt-C的蛋白和mRNA水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，48 h與5 d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1和表2。

表1 各組腦組織中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的比較 (n=10,±s,pg/ml)

表2 各組腦組織中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的比較 (n=10,±s)

3 討 論

腦出血后血腫周圍的繼發(fā)性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡。HIF-1α是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，任何氧濃度降低的條件下都可誘導(dǎo)細(xì)胞快速、大量的表達(dá)，在調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起重要作用〔4〕。HIF-1α表達(dá)增高可促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重腦水腫、病理學(xué)改變和炎癥反應(yīng)程度及神經(jīng)功能障礙〔5〕。Cyt-C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，定位于線粒體內(nèi)膜上，是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分〔6〕。細(xì)胞凋亡是受多基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，而線粒體Cyt-C是凋亡的重要啟動(dòng)因子之一〔7〕。凋亡過(guò)程中通過(guò)線粒體外膜釋放至胞質(zhì)導(dǎo)致Cyt-C缺乏，從而電子傳遞鏈被阻斷，導(dǎo)致ATP合成減少和不完全氧化造成活性氧(ROS)過(guò)度生成，導(dǎo)致線粒體外膜孔道的開放，進(jìn)一步引發(fā)線粒體內(nèi)容物的釋放，從而形成一個(gè)放大效應(yīng)的惡性循環(huán)〔8〕。HIF-1α與低氧促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)密切相關(guān)、Cyt-C參與細(xì)胞有氧呼吸活動(dòng)并在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦出血后腦組織中HIF-1α、Cyt-C的蛋白及mRNA水平增高可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙及加重繼發(fā)性腦損傷，阻斷二者的表達(dá)，為腦出血的治療提供新的靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

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