沉默信息調(diào)節(jié)因子1在腎臟衰老中的作用

葉 婷 寧 勇

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，湖北 武漢 430030)

衰老是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，受多種因素調(diào)控。目前關(guān)于衰老的理論主要有自由基學(xué)說、線粒體DNA損傷學(xué)說、端粒學(xué)說和衰老的基因?qū)W說等〔1〕。氧化損傷在腎臟衰老的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?，可通過調(diào)控新陳代謝(熱量消耗、脂肪貯存等)、維持氧化應(yīng)力下線粒體的正常功能、抑制炎癥以及細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面延緩細(xì)胞的衰老〔2〕。過去幾年，Sirt1已成為衰老研究中的主要領(lǐng)域，但對(duì)于Sirt1在腎臟衰老氧化損傷中的作用還鮮有報(bào)道。本文旨在探討Sirt1在腎臟衰老氧化損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本留取 SD雄性大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，常規(guī)條件下于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)，保持12 h的晝夜循環(huán)，室溫控制在23℃左右，濕度40%～50%，自由進(jìn)食水。分別飼養(yǎng)至3、24個(gè)月齡(青年組、衰老組，n=10)，斷頭處死，放血干凈，生理鹽水沖洗腎臟。一側(cè)腎臟迅速分割后，一半置于液氮保存，隨后-80℃保存留待蛋白質(zhì)等檢測(cè)中使用，一半留作病理檢查。對(duì)側(cè)腎臟立即制備組織勻漿。

1.2方法

1.2.1腎臟組織病理學(xué)分析 腎臟組織石蠟切片(2～3 μm)常規(guī)脫蠟入水，PAS 染色，普通光鏡下觀察腎臟組織病理改變。

1.2.2腎臟組織H2O2含量測(cè)定 腎臟組織勻漿按照H2O2檢測(cè)試劑盒(BioAssay System’s peroxide assay kit，Hayward，CA)說明書進(jìn)行。

1.2.3腎臟組織MDA測(cè)定 采用TBARS檢測(cè)試劑盒(Cat#10009055，Ann Arbor，MI)，操作參照說明書進(jìn)行。

1.2.4Western印跡 檢測(cè)硝基酪氨酸(nitrotyrosine)和Sirt1的蛋白表達(dá)水平 各組分別取20 μg蛋白，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的BSA封閉2 h，用1∶1 000稀釋的nitrotyrosine(Santa Cruz，Cat #sc-101358)和Sirt1(Santa Cruz，Cat # sc-15404)一抗4℃孵育過夜，用TBST振搖洗膜10 min×3次，以1∶5 000稀釋的羊抗兔生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h后，再次用TBST振搖洗膜10 min×3 次。ECL底物化學(xué)發(fā)光(Supersignal West Dura kit，Thermo Scientific)顯色后機(jī)器掃描存盤，以Scion Image 軟件進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié) 果

2.1腎臟組織病理學(xué)改變 衰老組可見腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死，部分小管囊狀擴(kuò)張、萎縮，局灶性小管消失，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。病變嚴(yán)重區(qū)域可見系膜增生，節(jié)段性腎小球硬化。見圖1。

圖1 腎臟組織病理改變(PAS，×400)

2.2腎臟組織H2O2含量 衰老組腎臟組織H2O2含量較對(duì)照組明顯升高〔(239.9±39.38)μmol/μg vs (110±19.49) μmol/μg〕(P=0.017)。

2.3腎臟組織MDA含量 衰老組腎臟組織MDA含量較對(duì)照組明顯升高〔(44.42±4.17) μmol/mg vs (26.23±1.43) μmol/mg〕(P<0.001)。

2.4腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達(dá) 衰老組腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P=0.007)。見圖2。

2.5腎臟組織Sirt1蛋白表達(dá) 衰老組腎臟組織Sirt1表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(P=0.002)。見圖3。

2.6Sirt1蛋白表達(dá)水平與MDA、H2O2、nitrotyrosine相關(guān)性分析 腎組織中Sirt1蛋白表達(dá)水平與MDA、H2O2含量及nitrotyrosine蛋白表達(dá)均呈線型負(fù)相關(guān)(r=-0.776、-0.808、-0.868，P均<0.05)。

圖2 Western印跡檢測(cè)腎臟組織nitrotyrosine蛋白表達(dá)

圖3 腎臟組織SIRT1蛋白質(zhì)表達(dá)

3 討 論

腎臟是衰老過程中人體器官中變化最為明顯的器官之一，正常人在超過40歲后，腎小球?yàn)V過率平均每年下降1%。腎臟衰老在形態(tài)上表現(xiàn)為體積和重量下降，皮質(zhì)相對(duì)萎縮、腎小球硬化、系膜基質(zhì)增殖、間質(zhì)纖維化以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)〔3〕。

衰老是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，受多種因素調(diào)控。腎臟內(nèi)的氧供十分豐富，血供量大，是機(jī)體內(nèi)最易產(chǎn)生氧自由基的器官之一。衰老的自由基理論認(rèn)為衰老是自由基對(duì)細(xì)胞成分的有害進(jìn)攻造成的。氧自由基造成的損害，一方面取決于氧自由基的產(chǎn)生，另一方面氧自由基的清除也起重要作用。氧自由基的產(chǎn)生及清除失去平衡是包括癌癥、2型糖尿病、肥胖相關(guān)性代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等多種衰老相關(guān)疾病的重要發(fā)病機(jī)制?！?〕

H2O2是一種極不穩(wěn)定的氧化物，易在體內(nèi)分解產(chǎn)生羥基自由基，造成細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，并降解為MDA。MDA可與蛋白質(zhì)、核酸及某些磷脂作用，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，加速細(xì)胞老化過程，最終引起細(xì)胞損傷、凋亡和多種疾病的發(fā)生。nitrotyrosine為內(nèi)源性過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)生成的特異性標(biāo)志物，作為一種很強(qiáng)的氧化劑，可有效地氧化蛋白質(zhì)巰基和鐵硫(Fe/S)中心酪氨酸殘基，使許多蛋白或酶失活，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，使DNA鏈斷裂，從而影響代謝、抑制呼吸酶、顯著減弱抗氧化酶清除氧自由基的能力、啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化，參與介導(dǎo)多種原因造成的組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老組大鼠腎臟組織中H2O2、MDA 、nitrotyrosine的含量均較青年組顯著升高，因此可以推測(cè)氧化損傷代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生介導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞損傷、凋亡、變性壞死，從而導(dǎo)致腎小球硬化、間質(zhì)纖維化等一系列病理及功能改變。

Sirt1是Sirtuins 家族最主要的成員，其靶蛋白包括組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等。作為最被廣泛和深入研究的Sirtuins家族成員，Sirt1在抗衰老、腫瘤、糖脂代謝和心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用〔4〕。Sirt1在腎臟組織中廣泛表達(dá)，在腎髓質(zhì)表達(dá)明顯高于皮質(zhì)，尤其高表達(dá)于內(nèi)髓部〔5〕。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Sirt1可抑制機(jī)體氧化應(yīng)激。在Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，適度上調(diào)Sirt1，可通過FOXO通路，促進(jìn)過氧化氫酶表達(dá)，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激水平〔6〕。Vinciguerra等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1可通過抑制氧化應(yīng)激抑制心肌衰竭進(jìn)程，改善心功能。Sirt1激活劑能增強(qiáng)視神經(jīng)中Sirt1表達(dá)，減少氧自由基產(chǎn)生，阻止神經(jīng)元的丟失和視神經(jīng)的炎癥性脫髓鞘〔8〕。在COPD大鼠模型，Sirt1激活劑能增強(qiáng)心臟SOD活性，緩解心肌氧化損傷和心室重塑〔9〕。在H2O2處理的H9C2細(xì)胞，Sirt1激活劑能誘導(dǎo)線粒體NDUFA1，NDUFA2，NDUFA13和Mn-SOD表達(dá)，減少氧自由基產(chǎn)生，這種作用可以被Sirt1抑制劑煙酰胺所抑制〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老組腎臟組織Sirt1表達(dá)較青年組明顯下降，并且Sirt1表達(dá)與氧化損傷產(chǎn)物負(fù)相關(guān)。因此，我們推測(cè)，隨著年齡的增長(zhǎng)，腎臟組織Sirt1表達(dá)逐漸降低，從而使機(jī)體抗氧化損傷的自我保護(hù)機(jī)制減弱，而介導(dǎo)腎臟衰老的發(fā)生發(fā)展。在近幾年的研究中，Sirt1已成為對(duì)于衰老和長(zhǎng)壽具有關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，在腎臟衰老中是否也能通過其他途徑發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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