腫瘤壞死因子-α對單核細(xì)胞妊娠相關(guān)血漿蛋白A表達(dá)的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制

李衛(wèi)萍 李虹偉 顧復(fù)生

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心血管中心，北京 100050)

單核細(xì)胞妊娠相關(guān)血(PAPP)-A與炎癥密切相關(guān)，促進(jìn)動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成，在急性冠脈綜合征(ACS)的早期診斷、危險分層及預(yù)后評估方面有重要的臨床應(yīng)用價值〔1，2〕。前期研究提示炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α可在轉(zhuǎn)錄水平上呈劑量時間依賴性誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞PAPP-A的基因表達(dá)，但具體細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)控機(jī)制尚不明確〔3〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于人體各種組織和細(xì)胞中，能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子及炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究探討NF-κB是否參與TNF-α對人外周血單核細(xì)胞PAPP-A基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1主要試劑 重組TNF-α(rhTNF-α)(美國Peprotech公司)；BAY11-7082(美國Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液(中科院血液病研究所)；核蛋白提取及NF-κB p65檢測試劑盒(美國Active Motif公司)；兔抗人PAPP-A抗體(美國Abcam公司)，膜蛋白提取試劑盒、兔抗β-actin抗體、羊抗兔二抗(北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、RNA酶抑制劑、dNTPs、Oligo(dT)15、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)；Trizol(美國Invitrogen公司)，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司)；PCR引物(北京賽百盛公司)。

1.2方法

1.2.1外周血單核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采集健康志愿者外周肘靜脈血20 ml，肝素400 U抗凝，生理鹽水1∶1稀釋。用尖頭吸管鋪于比重1.077淋巴細(xì)胞分離液表面，稀釋血與淋巴細(xì)胞分離液體積比為2∶1。室溫下2 500 r/min離心25 min，吸取中層單個核細(xì)胞，PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞重懸于RPMI1640。臺盼藍(lán)試驗示活細(xì)胞率>95%。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用37℃預(yù)熱的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次，將未貼壁細(xì)胞洗脫，經(jīng)瑞氏染色鑒定貼附細(xì)胞為單核細(xì)胞，占85%。

1.2.2細(xì)胞實驗分組 ①按不同作用時間分組：rhTNF-α(100 ng/ml)作用于人單核細(xì)胞不同時間(2、8、16和24 h)。②按不同作用濃度分組：rhTNF-α(25、50和100 ng/ml)作用于人單核細(xì)胞24 h。③BAY11-7082干預(yù)組：BAY11-7082(20 μmol/L)與人單核細(xì)胞共同孵育60 min。④TNF-α+ BAY11-7082組：先用BAY11-7082(20 μmol/L)與人單核細(xì)胞共同孵育60 min后，再加入rhTNF-α(100 ng/ml)作用24 h。

1.2.3觀察指標(biāo)的檢測

1.2.3.1Western印跡法檢測PAPP-A 蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，Lowry氏法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，將膜放入封閉液4 ℃過夜。洗膜后分別滴加兔抗人PAPP-A抗體和兔抗人β-actin抗體，室溫?fù)u床上孵育2 h，取出濾膜用TBST漂洗3次，然后滴加HRP-山羊抗兔IgG，室溫振搖孵育1 h，TBST漂洗3次，洗去未結(jié)合的二抗，最后進(jìn)行曝光、顯影、定影及凝膠圖像分析。

1.2.3.2實時熒光定量PCR 法檢測PAPP-A mRNA的表達(dá)水平 實驗結(jié)束時收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA后，測定RNA純度、濃度。純度指標(biāo)OD260/ OD280控制在1.8～2.0，濃度約為500 ng /μl。以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按試劑盒說明書進(jìn)行，總反應(yīng)體系為20 μl。陰性對照不含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA模板。所得cDNA 在熒光定量實時PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過GenBank獲得PAPP-A及β-actin基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物。PAPP-A上游引物 5′-GAG GAG TTG GCA GGA GTA GCA-3′，下游引物 5′-GCC CAG GCT GGC TGT GAC CAA T-3′，長度為141 bp。β-actin上游引物 5′-TGA AGA TCA AGA TCA TTG CTC C-3′，下游引物5′-GGG TGT AAC GCA ACT AAG TCA TA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度184 bp。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃10 min，95℃變性15 s，60℃退火和延伸1 min，共50個循環(huán)。每次擴(kuò)增的同時設(shè)置無cDNA的陰性對照，取PCR產(chǎn)物做熔解曲線，證實PCR產(chǎn)物的特異性。使用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)所得樣本Ct值計算標(biāo)準(zhǔn)的2-ΔΔCt值，表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3.3NF-κB活性檢測 采用Active Motif的專利技術(shù)TransAMTM定量檢測磷酸化NF-κB p65水平代表NF-κB活性。提取單核細(xì)胞的核蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度。待測樣品孔中每孔加入20 μl核蛋白提取液，將反應(yīng)板置于自動旋轉(zhuǎn)振蕩儀上，室溫下輕輕搖動(100 r/min)，反應(yīng)1 h后用緩沖液洗滌3次。加酶標(biāo)一抗反應(yīng)1 h，洗滌3次，再加酶標(biāo)二抗反應(yīng)1 h，洗滌4次。最后加底物顯色，終止后在酶標(biāo)儀上以主波長450 nm，次波長655 nm比色。根據(jù)重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的反應(yīng)吸光度值計算NF-κB p65的含量。以上實驗均重復(fù)6次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TNF-α誘導(dǎo)人單核細(xì)胞PAPP-A蛋白和mRNA表達(dá)的時間效應(yīng) 給予rhTNF-α(100 ng/ml)刺激單核細(xì)胞后，PAPP-A的蛋白表達(dá)在2 h開始升高，8 h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)下降，但在24 h仍高于空白對照組(P<0.05)。PAPP-A的mRNA表達(dá)在2 h即達(dá)到高峰，隨刺激時間延長，表達(dá)水平下降，在8 h達(dá)到平臺期，在16 h、24 h表達(dá)未出現(xiàn)進(jìn)一步下降，但仍高于空白對照組 (P<0.05)，見表1及圖1。

2.2TNF-α誘導(dǎo)人單核細(xì)胞PAPP-A蛋白和mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng) 給予不同濃度TNF-α(25、50和100 ng/ml)刺激24 h后，隨著TNF-α刺激濃度的增加，人單核細(xì)胞PAPP-A的蛋白和mRNA表達(dá)逐漸升高，均顯著高于空白對照組(P<0.05)，呈劑量依賴性，見表2及圖2。

2.3TNF-α對人單核細(xì)胞NF-κB活性的影響 在給予rhTNF-α(100 ng/ml)和人外周血單核細(xì)胞孵育24 h后，與對照組〔(0.39±0.03)mg/L〕比較，TNF-α組磷酸化NF-κB p65水平顯著升高〔(1.06±0.12)mg/L，P<0.05〕，而BAY11-7082組NF-κBp65水平顯著下降〔(0.21±0.05)mg/L，P<0.05〕，TNF-α+ BAY11-7082組磷酸化NF-κB p65水平〔(0.41±0.07)mg/L〕較TNF-α組降低(P<0.05)，與空白對照組相比無顯著差異。

表1 TNF-α對單核細(xì)胞PAPP-A蛋白和mRNA表達(dá)影響的時間效應(yīng)±s,n=6)

作用濃度蛋白mRNA空白對照組0.116 1±0.011.00±0.0225 ng/ml0.318 8±0.053 51)3.035±0.2061)50 ng/ml0.387 3±0.066 91)3.651±0.3221)100 ng/ml0.408 5±0.069 81)4.985±0.4021)

1：空白對照組；2：25 ng/ml組；3：50 ng/ml組；4：100 ng/ml組

2.4NF-κB參與TNF-α對人單核細(xì)胞PAPP-A表達(dá)的調(diào)控 先給予NF-κB抑制劑 BAY11-7082預(yù)處理60 min，再加入TNF-α(100 ng/ml)作用24 h后，人單核細(xì)胞PAPP-A的蛋白和mRNA表達(dá)較TNF-α刺激組顯著下降(P<0.05)，與空白對照組表達(dá)水平相似，見表3及圖3。

表3 不同處理組單核細(xì)胞PAPP-A蛋白和mRNA的表達(dá)±s,n=6)

1：空白對照組；2：BAY11-7082組；3：TNF-α組；4：TNF-α+BAY11-7082組

3 討 論

ACS是一種血栓性疾病，由于冠狀動脈不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊破裂和出血，促進(jìn)冠脈痙攣、血栓形成，導(dǎo)致心肌缺血壞死。研究證明動脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定與斑塊的大小無關(guān)，而炎癥浸潤及細(xì)胞外基質(zhì)降解是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的重要觸發(fā)因素。Bayes-Genis等〔4〕通過尸檢首次證實PAPP-A大量分布于易損斑塊的纖維帽肩部、脂質(zhì)核心周圍和巨噬細(xì)胞。在表面糜爛的纖維斑塊，PAPP-A定位于梭形平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，而在穩(wěn)定斑塊上無表達(dá)或極少量表達(dá)。同時研究還發(fā)現(xiàn)ACS時血漿PAPP-A濃度升高。此后越來越多的研究進(jìn)一步證實PAPP-A是預(yù)測不穩(wěn)定斑塊的標(biāo)志物。最近Conover等〔5〕報道ApoE基因敲除小鼠在給予PAPP-A轉(zhuǎn)基因表達(dá)后，主動脈粥樣斑塊病灶的面積增加3.5倍，而PAPP-A/ApoE雙基因敲除小鼠的主動脈病灶面積較單一ApoE基因敲除小鼠減少70%，提示PAPP-A可加劇動脈粥樣硬化進(jìn)展。Brügger-Andersen等〔6〕通過血栓抽吸裝置獲取急性ST抬高性心肌梗死患者罪犯血管的動脈粥樣血栓斑塊，采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)PAPP-A在斑塊的細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)豐富，而在血栓形成部位無表達(dá)。

既往研究結(jié)果顯示TNF、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-4等致炎癥前細(xì)胞因子可誘導(dǎo)培養(yǎng)的人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及成骨細(xì)胞PAPP-A基因的表達(dá)，而干擾素γ(INF-γ)可抑制人成纖維細(xì)胞表達(dá)PAPP-A〔7,8〕。單核細(xì)胞是動脈粥樣斑塊發(fā)生發(fā)展過程中最重要的炎癥細(xì)胞，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)ACS患者外周血單核細(xì)胞的mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組和穩(wěn)定性心絞痛組，且與外周血循環(huán)中的血清PAPP-A水平變化相似。本研究結(jié)果顯示TNF-α與外周血單核細(xì)胞共同孵育后，PAPP-A的蛋白和mRNA表達(dá)分別在8 h和2 h達(dá)到高峰，同時可呈劑量依賴性誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞PAPP-A的蛋白和mRNA表達(dá)，進(jìn)一步證實了PAPP-A與炎癥的相關(guān)性。

NF-κB是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因的表達(dá)。靜息狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)NF-κB與抑制因子IκB結(jié)合，以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到多種因素刺激后，IκB激酶激活，IκB磷酸化被降解，胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB易位至細(xì)胞核，與其靶基因中的NF-κB位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動各種靶基因的轉(zhuǎn)錄。近期研究表明TNF-α可誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人冠脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65和NF-κB p50亞單位的易位〔9〕，還可通過抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性阻斷NF-κB活化〔10〕。本研究顯示TNF-α可顯著升高人外周血單核細(xì)胞的磷酸化NF-κB p65水平，提示NF-κB活性增加。此外，在給予NF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理阻斷NF-κB途徑后，再予以TNF-α刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞磷酸化NF-κB p65水平的下降，提示NF-κB活性降低，同時PAPP-A蛋白及基因表達(dá)都較TNF-α刺激組顯著下降，與對照組相比無顯著差異。

本研究結(jié)果提示TNF-α可通過增加NF-κB活性，呈劑量依賴性誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞PAPP-A的蛋白和基因表達(dá)，進(jìn)一步明確了ACS患者外周血循環(huán)PAPP-A水平及外周血單核細(xì)胞PAPP-A表達(dá)增加的機(jī)制。目前PAPP-A在ACS早期診斷及預(yù)后分層方面的臨床應(yīng)用價值已得到越來越多學(xué)者的關(guān)注，但其在心血管系統(tǒng)特別是動脈粥樣硬化發(fā)展中的生物學(xué)作用還期待更深入的基礎(chǔ)實驗研究明確。

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