老年帕金森病大鼠模型皮質(zhì)中γ-氨基丁酸 A受體β亞基含量的變化

姚素艷 劉建生 金 濤 鄭德宇

(遼寧醫(yī)學院病理生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

帕金森病(PD)是指由各種病因引起的中腦黑質(zhì)致密部(SNc)的多巴胺能神經(jīng)元漸進性變性缺失，導(dǎo)致SNc投射到紋狀體(Str)神經(jīng)末稍釋放的多巴胺(DA)減少〔1，2〕。研究表明約50%的中樞神經(jīng)突觸部位以γ-氨基丁酸(GABA)為遞質(zhì)〔3，4〕，在人體大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、基底神經(jīng)節(jié)和小腦中起重要作用，并對機體的多種功能具有調(diào)節(jié)作用。GABA受體屬于受體門控通道超家族成員，其中GABA A受體主要分布于腦內(nèi)。動物及人體內(nèi)的 GABA受體由5個不同的亞單位組成，并且在分子的中心部位形成門控氯離子通道。β亞基具有GABA的結(jié)合位點，當GABA與突觸后膜的GABA A 受體的β亞基結(jié)合后，使整個受體產(chǎn)生變構(gòu)作用，打開氯離子通道，達到抑制突觸后神經(jīng)元的作用〔5，6〕。在PD狀態(tài)下，黑質(zhì)中GABA含量在某些核團升高，而在其他核團降低。在PD狀態(tài)下，在基底節(jié)環(huán)路的核團中，GABA A受體β亞基的含量是否會隨著GABA含量的變化而發(fā)生適應(yīng)性的變化還沒有明確的報道。本研究擬探討PD模型中GABA A受體β亞基的分布范圍及表達量是否存在變化。

1 材料和方法

1.1動物 40只雌性SD大鼠，230～240 g，12月齡， 遼寧醫(yī)學院動物中心提供。

1.2方法

1.2.1PD大鼠模型的制作及檢測 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，應(yīng)用托盤天平稱重，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，按照文獻〔7〕的方法向動物腦內(nèi)注射6-羥基DA(6-OHDA)，制作PD模型。在術(shù)后的第7天，按5 ml/kg體重腹腔內(nèi)注射鹽酸阿樸嗎啡溶液，注射5 min后開始記錄PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)情況。旋轉(zhuǎn)次數(shù)規(guī)定：大鼠向注射6-OHDA的另一側(cè)(右側(cè)，即健側(cè))不改變方向旋轉(zhuǎn)360°為1次。檢測1次/w，每次的記錄時間為40 min，連續(xù)檢測8 w。一般認為，平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7次/min可認為是成功的PD大鼠模型〔7〕。

1.2.2GABA A受體中β亞基的表達 選擇連續(xù)檢測8 w后成模的PD模型大鼠和正常SD大鼠，6%水合氯醛深度麻醉后應(yīng)用150 ml生理鹽水灌注以替換腦組織中的血液。灌注后斷頸處死動物，并在冰上迅速分離腦組織，在解剖顯微鏡(上海光學儀器廠、XYH-4A)下分離出皮質(zhì)和丘腦，稱重備用。

1.2.2.1高壓液相色譜分析測定組織勻漿中GABA含量 取稱重好的腦組織，按照1 000 μl/100 mg加入勻漿液，充分研磨，4℃，14 000 r/min離心15 min，小心吸出上清至另一新的高壓滅菌后的1.5 ml EP管中，再次離心收集上清，用0.45 μm濾膜過濾后收集濾液，應(yīng)用高壓液相色譜分析法(waters，2695)測定皮質(zhì)勻漿中GABA的含量。

1.2.2.2皮質(zhì)中GABA A受體中各β亞基mRNA的表達 取稱重好的腦組織，直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，按照1 ml/50 mg組織的比例加入Trizol，常規(guī)提取腦組織中的總RNA。根據(jù)各β亞基的mRNA序列設(shè)計下列引物，應(yīng)用RT-PCR方法檢測腦組織中各β亞基mRNA的表達。見表1。

表1 RT-PCR 的引物設(shè)計

取擴增后的PCR產(chǎn)物5 μl與1 μl溴酚藍混勻，加入0.1%瓊脂糖凝膠中，100 V電壓下電泳，觀察溴酚藍的位置，在紫外燈下拍照，將照片掃描后經(jīng)自動電泳凝膠圖像分析儀(MSD-2000)測定各個PCR條帶的灰度值，計算各個條帶的比灰度值。比灰度值=目的條帶的灰度值/β-actin擴增條帶的灰度值。

1.2.2.3皮質(zhì)、丘腦中GABA A受體各β亞基的蛋白表達水平檢測 腦組織稱重后直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，重復(fù)研磨三次。按200 μl組織蛋白抽提試劑/40 mg研磨組織向研磨物中加入預(yù)冷的蛋白提取試劑，常規(guī)提取組織總蛋白。測定并調(diào)整蛋白濃度，取相同量的蛋白樣品及標準marker上樣，應(yīng)用10%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離樣品后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入各個β亞基 的單克隆抗體4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1 h，化學發(fā)光法檢測，膜與化學發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影；經(jīng)自動電泳凝膠圖像分析儀(MSD-2000) 測定各個亞基的表達條帶與內(nèi)參β-actin條帶的比灰度值。比灰度值=目的基因的灰度值/β-actin的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1PD動物模型腦組織內(nèi)GABA含量的檢測 模型側(cè)皮質(zhì)部位(左側(cè))〔(3.07±0.6)μmol/g組織〕與對照側(cè)(右側(cè))〔(2.54±0.47)μmol/g組織〕及正常對照(左側(cè))〔(2.46±0.53)μmol/g組織〕相比，GABA的含量明顯升高(P<0.05)。

2.2qRT-PCR方法檢測GABA A受體中各β亞基的mRNA水平 在損傷側(cè)皮質(zhì)中β1亞基(P<0.05)、β2亞基(P<0.01)和β3亞基(P<0.01)的mRNA水平均較對照側(cè)及正常對照組低，但β1亞基的含量明顯低于β2亞基和β3亞基。見表2；圖1。

β1：GABA A受體β1亞基；β2：GABA A受體β2亞基；β3：GABA A受體β3亞基；β：β-actin

Cortex損傷側(cè)(左側(cè))對照側(cè)(右側(cè))正常對照(左側(cè))β1亞基0.088±0.0420.108±0.0321)0.100±0.0241)β2亞基0.234±0.0743)0.305±0.0862)3)0.298±0.0432)3)β3亞基0.245±0.0543)0.309±0.0712)3)0.315±0.0262)3)

2.3PD大鼠模型皮質(zhì)中GABA A受體各β亞基的蛋白表達水平 在皮質(zhì)中，β2亞基和β3亞基的表達豐度明顯高于β1亞基，三者與對照側(cè)及正常對照側(cè)皮質(zhì)相比，表達量均有所降低(P<0.05，P<0.01)。見表3，圖2。

Cortex損傷側(cè)(左側(cè))對照側(cè)(右側(cè))正常對照(左側(cè))β10.067±0.0200.092±0.0171)0.097±0.0111)β20.214±0.0533)0.279±0.0322)3)0.291±0.0312)3)β30.205±0.0323)0.253±0.0272)3)0.249±0.0353)3)

3 討 論

在PD狀態(tài)下，由于SNc DA氨能神經(jīng)元的變性缺失，投射到紋狀體的AD能神經(jīng)元末梢釋放的DA減少，紋狀體中DA的含量降低，導(dǎo)致基底節(jié)環(huán)路中直接通路和間接通路的紊亂、失衡，從而引起一系列的PD癥狀〔8，9〕。而皮質(zhì)對紋體具有調(diào)節(jié)的作用，在PD狀態(tài)下，是否在皮質(zhì)中也存在遞質(zhì)含量異常，進而加劇了基底節(jié)環(huán)路的紊亂？本研究結(jié)果說明在PD狀態(tài)下，不僅僅是基底節(jié)環(huán)路的平衡被打破、神經(jīng)遞質(zhì)異常的升高或降低均可引起環(huán)路中核團的異常興奮或抑制；而且這種變化也出現(xiàn)在皮質(zhì)中，引起皮質(zhì)中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA含量升高，也可能會導(dǎo)致皮質(zhì)的興奮性受到抑制，進而皮質(zhì)對紋狀體的調(diào)節(jié)作用減弱，加劇了PD的癥狀。

在腦內(nèi)，GABA的受體主要是GABA A亞型。GABA A受體亞型有19種亞基，包括α1-6，β1-3，γ1-3，δ，ε，π，θ，和 ρ1-3亞基〔10，11〕。其中α亞基與GABA AR的調(diào)節(jié)物(如苯二氮卓類等藥物和巴比妥類藥物)結(jié)合后可以改變受體的構(gòu)象，促進受體的β亞基與GABA結(jié)合而產(chǎn)生生物學效應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA A受體至少由一種α、β與γ2組成，其中α2β2γ2分布最廣，在多數(shù)部位也存在受體共存的現(xiàn)象〔12，13〕。在本實驗中，無論是從mRNA的水平，還是從蛋白質(zhì)水平，均有證據(jù)表明皮質(zhì)中存在GABA A受體共存的現(xiàn)象。此外，GABA A受體的β亞基1～3均有不同程度的降低，說明PD動物模型皮質(zhì)中，GABA A受體的總量呈下降趨勢。

在PD狀態(tài)下，由于紋狀體中DA的含量降低，導(dǎo)致在基底節(jié)神經(jīng)環(huán)路的一些核團中神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)生了變化，引起PD的癥狀。大腦皮質(zhì)在整個基底節(jié)環(huán)路中起到調(diào)節(jié)、活化的作用，接受多個核團的纖維投射，既有興奮性的投射，也有抑制性的投射〔14～16〕。本研究結(jié)果顯示，在皮質(zhì)中存在因神經(jīng)遞質(zhì)含量升高而受體下調(diào)的現(xiàn)象。皮質(zhì)中GABA含量及GABA受體含量的變化可能為PD的實驗治療提出了一個新的問題，也為本課題組今后PD治療方面積累了重要的數(shù)據(jù)。

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