胰島素生長因子結(jié)合蛋白-2 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

許淑芬 王英凱 劉 磊 孫牧男 馬寅芙 方艷秋 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021)

胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-2與大腦發(fā)育有關(guān)〔1〕。腦中IGFBP-2在一些急、慢性非生理狀態(tài)下會(huì)升高，如外傷、缺氧、細(xì)胞再生等，升高的IGFBP-2來源于活化的星形細(xì)胞及微膠質(zhì)細(xì)胞。Sallinen等〔2〕發(fā)現(xiàn)，高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中IGFBP-2高表達(dá)，其表達(dá)越高，愈后越差。Elmlinger等〔3〕發(fā)現(xiàn),大量表達(dá)IGFBP-2的細(xì)胞常聚集于腫瘤壞死灶附近。Muller等〔4〕發(fā)現(xiàn),中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病人腦脊液IGFBP-2顯著升高。提示IGFBP-2可能作為膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。RNA干擾(RNAi)是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，具有重要生物學(xué)和臨床意義。本研究擬構(gòu)建針對IGFBP-2的siRNA表達(dá)載體，通過RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)IGFBP-2基因沉默，為腦膠瘤基因治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株、大腸桿菌DH5α、pSilencer 2.1-U6 neo載體本室保存； Trizol Reagent、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV Reverse transcriptase為Promega公司產(chǎn)品；Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ均為Takara公司產(chǎn)品, 胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；單克隆抗體及二抗購自北京晶美公司；引物由賽百盛公司合成。

1.2IGFBP-2 siRNA、IGFBP-2、β-actin引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中報(bào)道的IGFBP-2核苷酸序列(NM-000597)，參考siRNA及引物的設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司siRNA在線設(shè)計(jì)軟件，從IGFBP-2核苷酸序列起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，篩選得到576～594 nt、908～926 nt、938～956 nt 3個(gè)19 bp片段為靶序列，設(shè)計(jì)的siRNA序列5'端和3'端分別引入BamHⅠ、HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，加入9 bp的loop環(huán)結(jié)構(gòu)，3'末端加轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTTT。采用國際通用的與所有基因均無同源性的序列siRNA為陰性對照，見表1。經(jīng)BlastSearch檢索確認(rèn)與IGFBP-2以外的人類已知基因序列無同源性。

1.3寡核苷酸退火 將合成的IGFBP-2及陰性對照siRNA寡核苷酸分別溶解在50 μl無核酸酶的水中，后各取2 μl加入6 μl 10×退火緩沖液。90℃孵育3 min，緩慢降溫，37℃孵育1 h，然后緩慢冷卻至4℃；2%瓊脂糖電泳。

1.4重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 pSilencer 2.1-U6經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切線性化。取2 μl上述各組退火產(chǎn)物， 1 μl雙酶切后線性化的pSilencer 2.1-U6載體，1 μl 10×T4連接酶緩沖液、1 μl T4 DNA連接酶，5 μl無核酸酶去離子水，建立連接反應(yīng)，16℃過夜連接。次日分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)板中，37℃過夜。提取質(zhì)粒，酶切、測序鑒定,篩選出陽性克隆。

1.5重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及篩選 取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔板，密度達(dá)80%時(shí)，用IipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h以后更換含20%FBS培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。G418篩選，收集G418抗性細(xì)胞。

1.6RT-PCR檢測IGFBP-2 mRNA的表達(dá) 參照Invitrogen公司說明，使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，選擇β-actin作為內(nèi)參照。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃45 s、55℃45 s、72℃45 s，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果。

1.7Western印跡分析IGFBP-2 蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，蛋白變性，測定蛋白的含量。取適量樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；用半干式轉(zhuǎn)移電泳儀電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜3 h , 3 %BSA 封閉液4℃過夜, 1×PBS 洗膜,加入鼠抗人IGFBP-2 單抗(1∶500) , 37℃結(jié)合2 h , 洗膜, 加入馬抗小鼠IgG (1∶500) , 37℃結(jié)合2 h , 洗膜, 充分洗滌顯色，化學(xué)發(fā)光儀檢測PVDF膜上IGFBP-2蛋白的表達(dá)。

表1 針對IGFBP-2基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1重組載體測序及酶切鑒定 重組載體測序結(jié)果證實(shí)IGFBP-2 siRNA成功構(gòu)建于pSilencer 2.1-U6載體上，與目的序列相同。將重組質(zhì)粒pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-2、pSilencer 2.1-IGFBP-3、pSilencer 2.1-IGFBP-NC經(jīng)BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切產(chǎn)生約65 bp 大小的目的片段。見圖1。

2.2RT-PCR檢測IGFBP-2 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1(0.229±0.018 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-2(0.008±0.005 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-3(0.173±0.035 1)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞與3個(gè)對照組相比IGFBP-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用強(qiáng)于pSilencer 2.1-IGFBP-1和pSilencer 2.1-IGFBP-3，幾乎完全抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而3個(gè)對照組〔(無關(guān)siRNA對照組(0.476±0.044 2)、空載體對照組(0.494±0.065 2)和U251細(xì)胞對照組(0.418±0.045 2)〕細(xì)胞中都存在較高水平的IGFBP-2 mRNA表達(dá)。見圖2。

M:DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000+15000;1:無關(guān) siRNA 退火產(chǎn)物;2:pSilencer 2.1-IGFBP-1雙酶切;3:pSilencer 2.1-IGFBP-2雙酶切;4:pSilencer 2.1-IGFBP-3雙酶切;5:pSilencer 2.1-IGFBP-3雙酶切

M:DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000+15000;1:U251細(xì)胞； 2:轉(zhuǎn)染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-U6； 4:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-3

1:U251細(xì)胞； 2:轉(zhuǎn)染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-U6； 4:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:轉(zhuǎn)染pSilencer 2.1-IGFBP-3

2.3Western印跡分析IGFBP-2 蛋白的表達(dá) 圖3可見，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與3個(gè)對照組相比IGFBP-2蛋白表達(dá)明顯降低，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用強(qiáng)于pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-3，而3個(gè)對照組(無關(guān)siRNA對照組、空載體對照組和U251細(xì)胞對照組)細(xì)胞中都有較高水平的IGFBP-2蛋白表達(dá)。

3 討 論

IGFBP-2屬于胰島素樣生長因子家族，可通過IGF依賴和非依賴性作用發(fā)揮其生物學(xué)功能，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、促血管生成、促細(xì)胞遷移和促腫瘤侵襲性作用〔5～8〕。用基因表達(dá)微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人類進(jìn)展期神經(jīng)膠質(zhì)瘤及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，IGFBP-2基因表達(dá)異常升高，進(jìn)一步的研究提示，IFBP-2基因高表達(dá)將有利于腫瘤的侵襲〔9〕。有作者發(fā)現(xiàn)，IGFBP-2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤SNB19細(xì)胞中的過度表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能，且造成腫瘤發(fā)展的部分原因是由于IGFBP-2的過度表達(dá)導(dǎo)致MMP-2的表達(dá)增加，促進(jìn)了腫瘤的侵襲〔7〕。許多文獻(xiàn)證明 中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤血漿、組織ICFBP-2水平明顯上調(diào)〔10，11〕，且隨著IGFBP-2水平增高愈后不良〔12，13〕。因此提示IGFBP-2可能作為膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)，通過降低IGFBP-2水平抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡。

RNAi現(xiàn)象的特點(diǎn)：高度特異性，高沉默效率，高穿透性，只有針對編碼區(qū)的dsRNA序列才能產(chǎn)生有效特異性干擾，對內(nèi)含子和啟動(dòng)子則不能產(chǎn)生〔5，6〕。目前制備siRNA的方法主要是體外合成和體內(nèi)表達(dá)。體外化學(xué)合成方法價(jià)格昂貴，抑制效果維持時(shí)間短。體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA以DNA寡核苷酸為模板，在體外轉(zhuǎn)錄合成,優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但是反應(yīng)規(guī)模受到限制，適合于篩選。使用質(zhì)粒DNA構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體可在細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間、穩(wěn)定地生成小干擾RNA，使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)長期沉默成為可能〔14〕。本研究使用的pSilencer 2.1-U6 neo帶U6啟動(dòng)子和一個(gè)有6個(gè)T的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。將編碼IGFBP-2基因的特異序列(其RNA能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu))插人載體U6啟動(dòng)子的下游，轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞內(nèi)，載體從一個(gè)保守的A開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到連續(xù)的T即在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第2個(gè)堿基處終止轉(zhuǎn)錄，從而表達(dá)出shRNA，shRNA很快在細(xì)胞中被加工成為siRNA，隨后啟動(dòng)RNAi過程。采用這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于合成siRNA的過程轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，排除了RNA酶的干擾，延長了siRNA的半衰期；同時(shí)由于載體可以復(fù)制和擴(kuò)增，所以能夠顯著降低siRNA的成本；另外，利用該方法可以進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。隨著載體質(zhì)粒的復(fù)制擴(kuò)增，RNAi可以擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體，基因抑制效果可以傳代。本研究設(shè)計(jì)了能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對IGFBP-2基因的shRNA的質(zhì)粒并將其導(dǎo)人U251細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi質(zhì)粒載體的導(dǎo)入明顯抑制了IGFBP-2 mRNA以及蛋白的表達(dá)?？召|(zhì)粒組與空白對照組的結(jié)果差異無顯著性，排除了質(zhì)粒本身對基因的抑制作用。陰性對照組與空白對照組的結(jié)果差異亦無顯著性，說明了RNAi的高度特異性。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了靶向IGFBP-2基因的siRNA載體，并能有效抑制U251細(xì)胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，其中以pSilencer-IGFBP-siRNA2的沉默效果最強(qiáng)，為進(jìn)一步研究利用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤奠定了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

1Russo VC，Gluckman PD，F(xiàn)eldman EL，etal.The insulin-like growth factor system and its pleiotropic functions in brain〔J〕.Endocr Rev，2005;26(7)：916-43.

2Sallinen SL，Sallinen PK，Haapasalo HK，etal.Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques〔J〕.Cancer Res，2000;60(23)：6617-22.

3Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，etal.In vivo expression of insulin-like growth factor-binding protein-2 in human gliomas increases with the tumor grade 〔J〕.Endocrinology，2001;142(4)：1652-8.

4Muller HL，Oh Y，Lehrnbecher T，etal.Insulin-like growth factor-binding protein-2 concentrations in cerebrospinal fluid and serum of children with malignant solid tumors or acute leukemia〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，1994;79(2)：428-34.

5Godard S，Getz G，Delorenzi M，etal.Classification of human astrocytie gliomas on the basis of gene expression：a correlated group of genes with angiogenic activity emerges as a strong predictor of subtypes〔J〕.Cancer Res，2003；63：6613-25.

6Wang GK，Hu L，F(xiàn)uller GN，etal.An interaction between insulin-like growth factor binding protein 2(IGFBP2) and integrin alpha 5 is essential for IGFBP-2.induced cell mobility〔J〕.J Biol Chem，2006；281：14085-91.

7Wang H，Wang H，Shen W，etal.Insulin-like growth factor binding protein 2 enhances glioblastoma invasion by activating invasion-enhancing genes〔J〕.Cancer Res，2003;63：4315-21.

8Zhou YH，Hess KR，Liu L，etal.Modeling prognosis for patients with malignant astrocytic gliomas：quantifying the expression of multiple genetic markers and clinical variables〔J〕.Neuro-oncol，2005;7：485-94.

9Zhang w，Wang H，Song SW，etal.Insulin-like growth factor binding protein 2:gene expression microarrays and the hypothesis-generation paradigm〔J〕.Brain Patho,2002;12(1):87-94.

10Lin Y, Jiang T, Zhou K,etal. Plasma IGFBP-2 levels predict clinical outcomes of patients with high-grade gliomas 〔J〕. Neuro Oncol, 2009;11(5):468-76.

11李方成,戴學(xué)元,陶宗玉,等.胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2004;21(5)： 594-5.

12Yang P, Yan W, Zhang W，etal.Whole-genome messenger RNA profiling reveals genes involved in malignant progression of glioma〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2013;93(1):5-7.

13Han S, Meng L, Han S,etal.Plasma IGFBP-2 levels after postoperative combined radiotherapy and chemotherapy predict prognosis in elderly glioblastoma patients〔J〕. PLoS One,2014;9(4):e93791.

14Paddison PJ,Caudy AA,Bemstein E.Shore baipin RNAs(shRNA) induce sequence-specific silencing in mammalian cells〔J〕.Genes Dev,2002;16(8):948.