皮膚病理性瘢痕及瘢痕癌組織中Smad mRNA和蛋白檢測及基因突變

李明華 劉進輝 白曉龍 李宏偉 呂東亮 郭京麗 劉冬梅 宋 斌

(吉林省人民醫(yī)院燒傷整形外科，吉林 長春 130021)

皮膚瘢痕的產(chǎn)生是機體對創(chuàng)傷修復(fù)正常的、必然的生理反應(yīng)，也是創(chuàng)傷愈合過程的必然結(jié)果。瘢痕不具備正常皮膚組織結(jié)構(gòu)及生理功能，是一種失去正常組織活力的、異常的、不健全的組織。病理性皮膚瘢痕又稱為異常疤痕，是增生性瘢痕(HS)和瘢痕疙瘩(K)的統(tǒng)稱，是以膠原等大量結(jié)締組織基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積的皮膚纖維化疾病。有研究表明病理性瘢痕的發(fā)生率波動于8%～16%，部分病理性瘢痕具有增殖性，呈現(xiàn)持續(xù)生長亢奮表現(xiàn)，不但影響患者的美觀、生理功能，且在長期受壓、持重、牽拉、摩擦、抓癢等不良刺激影響下有癌變可能〔1～3〕。絲/蘇氨酸激酶受體(Smad)是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要標志性因子，介導(dǎo)了TGF-β的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而TGF-β信號傳導(dǎo)通路廣泛參與細胞及組織的生理病理過程，且尤與細胞基質(zhì)沉淀以及纖維化密切相關(guān)，是傷口愈合及瘢痕形成的主要生物信號途徑之一。本文通過觀察不同瘢痕組織的smad因子擬揭示瘢痕癌及其他纖維化疾病、癌癥的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 標本來源于本院2009年1月至2013年2月病理科。20份病理性瘢痕組織標本設(shè)為觀察A組，男11例，女9例，年齡29～81〔平均(42±5.32)〕歲，來源部位：頭面部9例，上肢6例，下肢5例，均有疤痕形成史。20份瘢痕癌組織標本設(shè)為觀察B組，男10例，女10例，年齡30～81〔平均(42±7.11)〕歲，來源部位：頭面部8例，上肢7例，下肢4例，臀部1例，疤痕形成原因：火燒傷11例，電擊2例，油燙傷7例。20份正常皮膚組織設(shè)為對照組，男11例，女9例，年齡31～82〔平均(43±6.91)〕歲，部位：頭面部7例，上肢8例，下肢3例，臀部2例。三組標本年齡、性別、來源部位等一般情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化(SP)進行檢測，抗體使用兔抗人Smad單克隆抗體(Abcam生物公司)，操作按照說明書進行。結(jié)果判定：Smad陽性表達是細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒；每張切片隨機選擇5個視野，統(tǒng)計著色細胞與未著色細胞的比值(陽性率)。根據(jù)陽性率×染色強度計分的乘積將免疫組化陽性等級分為4個等級：陰性：積分<2分；弱陽性：積分2～3分；陽性：積分4～6分；強陽性：積分>6分〔4〕。

1.2.2實時熒光(Real-time)PCR dNTP、Pfu酶均購于上海生工生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生工生物工程公司，基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司。三組組織的標本各100 mg加入500 μl的Trizol試劑( Invtrogene公司)和100 μl的氯仿，均勻混合后置于離心機14 000 r/min離心10 min，將上層水相置于新的EP管后加入同等體積將RNA沉淀，干燥后加入10 μl用DEPC處理去離子水溶解的RNA沉淀，置于-80℃保存。針對國內(nèi)Smad的基因片段保守區(qū)域，根據(jù)GenBank收錄的Smad基因序列設(shè)計引物，Smad正義：5′-CGCTTGATCCAAAGTGGAAT-3′，反義：5′-GGTTGATGGCATTGGAAAGA-3 ′；GAPDH正義：5′-ACTTAGTT-GCGTTACACCCTTTCT-3′，反義：5′-TTCATACATCTCAAGTTGGGGGAC-3′。由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司合成并標記。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 15 min；變性95℃ 40 s，退火62℃，延伸72℃ 60 s，共35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物為800 bp。擴增Ct值利用lightcycler熒光定量PCR儀配備軟件進行分析。以對照組ΔCt值作為校正，根據(jù)2-ΔΔCT數(shù)值計算得出檢測指標基因濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用等級相關(guān)(Spearman)分析及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化結(jié)果 Smad陽性染色部位以細胞質(zhì)為主，觀察B組陽性表達率為57.34%，高于觀察A組和對照組(分別為11.77%、11.69%)(P<0.05)，觀察A組和對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 三組Smad蛋白表達情況

2.2Real-Time PCR結(jié)果 觀察B組Smad基因表達水平(2.99±1.09)高于觀察A組(1.39±0.78)和對照組(設(shè)為1)(P<0.05)，觀察A組和對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.3Smad與Smad mRNA相關(guān)性分析 瘢痕癌標本中Smad蛋白與Smad mRNA的表達有正相關(guān)關(guān)系(r=0.752，P=0.001)。

2.4Smad基因突變分析 PCR擴增后在40例無任何血緣關(guān)系的標本樣品中擴增出200 bp的Smad基因6例，其中病理性瘢痕及瘢痕癌各3例(圖2)；致病性與非致病性突變位點未在測序時發(fā)現(xiàn)。

1～3：病理性瘢痕；4～6：瘢痕癌

3 討 論

創(chuàng)傷傷口愈合經(jīng)過上皮化環(huán)節(jié)后，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成纖維細胞內(nèi)被激活，使體內(nèi)合成和分泌更多的TGF-β受體，靶基因被持續(xù)性啟動；又由于TGF-β信號傳導(dǎo)通路與細胞基質(zhì)沉淀以及纖維化密切相關(guān)，通路被過度激活后導(dǎo)致細胞外基質(zhì)被過度沉淀，最終形成疤痕。Smad是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的標志性蛋白，Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導(dǎo)至細胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，TGF-β1對細胞進行刺激后，TGF-β1型受體被磷酸化，與下游的Smad2/Smad3相互識別編碼后被活化，與此同時與Smad4結(jié)合成由異源寡聚體形成的復(fù)合體，繼而發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核后啟動靶基因，促進靶基因的啟動和轉(zhuǎn)錄。Smad7在Smad家族中發(fā)揮抑制TGF-β1的作用，通過負反饋的效能降低TGF-β1的強度和活性時間，同時抑制TGF-β/Smad信號通路激活〔5～9〕。

Smad蛋白能夠抑制和分化角質(zhì)細胞，角質(zhì)細胞分泌的角質(zhì)細胞生長因子對組織損傷具有明顯的促進修復(fù)和保護作用，Smad在一定程度上削弱了角質(zhì)細胞修復(fù)組織的作用，Annes等〔9〕發(fā)現(xiàn)Smad3基因敲除小鼠體內(nèi)角質(zhì)細胞分裂更快，燒傷創(chuàng)面感染率下降，傷口愈合恢復(fù)更迅速，這一結(jié)果提示TGF-β信號通路通過Smad蛋白抑制角質(zhì)細胞的增殖而影響傷口組織愈合。本研究結(jié)果提示瘢痕癌中Smad的高表達可能與癌變相關(guān)，Smad蛋白可能是瘢痕上皮癌變的危險信號。故筆者認為抑制Smad蛋白的活性和濃度，可加速上皮細胞的增殖分化，下調(diào)沉淀基質(zhì)的數(shù)量，減少創(chuàng)口肉芽組織形成，減少瘢痕傷口在不良刺激作用下發(fā)生癌變的風(fēng)險。

Smad基因突變或者缺失會影響細胞正常分化，出現(xiàn)蛋白功能異?！?0，11〕。本研究擴增突變基因檢測結(jié)果顯示6條目的條帶均未見致病性與非致病性突變位點，筆者認為出現(xiàn)這一結(jié)果不排除與本次研究標本量較少有關(guān)。

總之，Smad表達升高可能與瘢痕癌相關(guān)，下調(diào)Smads基因表達和抑制Smad蛋白活性將可能成為治療瘢痕癌的藥物靶方向，從Smad角度研究病理性疤痕皮膚和疤痕癌之間發(fā)生發(fā)展時間關(guān)系是可行的。

4 參考文獻

1Zhang Y，Chang C，Gehling DJ，etal.Regulation of Smad degraduation and activity by Smurf2，an E3 ubiquitin ligase〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011；98(3)：974-9.

2Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus〔J〕.Cell，2011；113(6)：685-700.

3Renzoni EA，Abraham DJ，Howat S，etal.Gene expression profilingreveals novel TGFbeta targetsin adultlung fibroblasts〔J〕.RespirRes，2004；5：24.

4Cai Y，Shen XZ，Zhou CH，etal.Abnormal expression of Smurf2 during the process of rat liver fibrosis〔J〕.Chin J Dig Dis，2010；7(4)：237-45.

5楊 力.Smad蛋白家族與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)〔J〕.中國美容醫(yī)學(xué)，2011;10(6)：547-9.

6趙自然，劉鶴松，路來金.轉(zhuǎn)化生長因子-β與瘢痕形成和創(chuàng)傷愈合〔J〕.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010；14(1)：53-5.

7王振宜，章 云，李 斌.Tgf-β在創(chuàng)面愈合及瘢痕形成中作用的研究進展〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2011；10(6)：463-4.

8夏 煒，郭樹忠.增生性瘢痕不同時期tgfβ1及其受體的表達〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009；20(11)：934-6.

9李 欣，戴立里.轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其與肝纖維化的關(guān)系〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2007；36(18)：1887-9.

10Annes JP，Munger JS，Rifkin DB.Making sense of latent TGF beta activation〔J〕.J Cell Sci，2009；116(Pt 2)：217-24.

11陳 琛，葉冬梅，邵淑娟.轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號通路研究進展〔J〕.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2011；3(2)：126-8，32.