人糞便中UNC5C基因甲基化在早期診斷大腸癌中的臨床意義

孫冬生 王 剛 王明君 鐘 軒 費樂學

(唐山開灤總醫(yī)院腫瘤科，河北 唐山 063000)

早期發(fā)現(xiàn)的大腸癌病變，有助于將局限在腸壁的腫瘤及時行外科手術切除，而且手術治愈率可高達90%〔1〕；但晚期并有淋巴轉移的患者預后較差，5年生存率只有5%〔2〕。研究表明，通早期篩查大腸癌可降低大腸癌的死亡率及提高患者5年生存率〔3〕。UNC5C基因可能參與大腸癌的發(fā)生過程〔4〕。因此，本研究通過重亞硫酸鹽限制性內切酶法(COBRA)方法檢測人糞便中UNC5C基因甲基化的狀態(tài)，探究人糞便中UNC5C基因甲基化對于早期診斷大腸癌的臨床意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2010年12月至2013年12月我院收治的大腸癌病人52例及健康體檢者40例，所有患者均經(jīng)病理檢查確診。大腸癌患者男28例，女24例，年齡39～75〔平均(60.4±14.6)〕歲；健康體檢者男20例，女20例，年齡41～72〔平均(59.3±13.5)〕歲；經(jīng)檢驗兩類研究對象的年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有的研究對象均在知情下簽署同意書，大腸癌納入標準〔5〕：(1)只患大腸癌，無其他腫瘤；(2)首次確診病例；(3)收集標本前未治療和操作性腸道檢查；(4)無其他重要臟器，如心、肺、腎等的病變。

1.2主要儀器 德國Analytik Jena AG公司的flexcycler PCR儀；美國Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型電泳儀；美國Bio-Rad公司Sub-Cell GT 電泳槽；加拿大carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝膠成像的分析系統(tǒng)；美國Thermo公司Ultro freeze 3410超低溫冰箱；中國寧波永新光學股份有限公司NIB-100型顯微鏡；美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)，310測序儀等。

1.3主要試劑 PCR擴增引物中各序列均由上海的英駿公司設計合成；瓊脂糖產(chǎn)于美國的Promega公司；寶生物TEXPAT試劑盒；EZ DNA Methylation KitTM。亞硫酸鹽(sigma)、苯二酚(Hydroquinone，sigma)、緩沖液(Promega 公司)

1.4糞便DNA提取 取1 mg糞便放入裝有1.5 ml裂解液(1 mol/L Tris 5 ml+0.5 mol/L EDTA 1 ml)的2 ml離心管中，95℃加熱10 min后充分振蕩；5 000 r/min離心5 min(室溫)；取上清液放入新的2 ml離心管中。改良的亞硫酸鹽液體配制：取1.8 g亞硫酸鹽，放入50 ml離心管中；加入純凈水2 ml、12.5 mol/L的NaOH 100 μl及10 mmol/L對苯二酚300 μl。充分振蕩后微波爐加溫(數(shù)秒鐘)，再次振蕩使之完全溶解。糞便上清液200 μl+上述2溶液150 μl(最終亞硫酸鹽濃度2.63 mol/L)；溫度條件：95℃ 15 min，4℃ 10 min，75℃ 60 min。取350 μl的M-Binging緩沖液，放入經(jīng)過上述處理后的溶液中，混勻后放入Zymo-Spin IC Column中500 r/min離心5 min(室溫)；加入M-Desulphonation緩沖液200 μl，500 r/min離心5 min(室溫)；此操作充分兩次。最后加入純凈水40 μl，室溫放置10 min后離心。溶出液作為PCR擴增時DNA模板使用。

1.5甲基化引物(熒光標記) UNC5c區(qū)域1正義：GTYGGTTGGGGTAGTGTAAAAGTT，熒光標記VIC；反義：AACCTACCRCCTACCACCTTCTTC，產(chǎn)物長度：175 bp，酶切后長度：175 bp，146 bp；HhaⅠ 37℃,12 h。區(qū)域2正義：TTTAGTGGGGTTTTTAGTTGTTTG，反義：TATCCCAATCCCAATCCRCAAC，熒光標記FAM，產(chǎn)物長度：125 bp，酶切后長度：125 bp，100 bp；Hha Ⅰ37℃，12 h。

2 結 果

2.1經(jīng)酶切后310測序儀電泳結果 經(jīng)酶切后310測序儀電泳結果顯示，大腸癌患者糞便UNC5C 區(qū)域1和區(qū)域2均呈現(xiàn)甲基化，健康人群糞便UNC5C無廣泛甲基化。

2.2各組對象糞便標本甲基化情況比較 廣泛UNC5C的甲基化(區(qū)域1和區(qū)域2均甲基化)及部分甲基化(區(qū)域1或區(qū)域2均甲基化)在大腸癌患者糞便、健康體檢者中分為81%(42/52)及54%(28/52)；0%(0/40)及10%(4/40)。大腸癌患者10例、健康體檢者36例糞便標本中無甲基化(P<0.05)。無論廣泛還是部分UNC5C的甲基化率大腸癌患者糞便的檢出率均明顯高于健康體檢者(P<0.05)。

2.3大腸癌患者與COBRA法檢測糞便的相關病理資料的關系 大腸癌患者COBRA檢測糞便結果與患者的性別，年齡，腫瘤發(fā)生部位，腫瘤大小以及腫瘤分期沒有顯著的相關性(P>0.05)。見表1。

表1 COBRA法檢測結果與大腸癌患者臨床病理資料的關系〔n(%)〕

3 討 論

目前臨床上大腸癌篩檢常用糞便隱血檢查，腸鏡檢查等。糞便隱血檢查的靈敏度較低，腸鏡檢查給受檢者帶來巨大的不適感，也十分不方便。而糞便中DNA甲基化檢測技術是作為一種新型的技術，分析糞便中DNA的異常甲基化程度，優(yōu)化了兩種方式的優(yōu)點，有較高的靈敏度和特異度，而且這種檢驗方法是非侵襲性的。目前許多研究證實了糞便中DNA甲基化檢測的可行性，但許多實驗的結果并不穩(wěn)定，得出的靈敏度和特異度的差異較大〔6〕，而且沒有固定的特異性的基因作為診斷標記物。我國的學者研究糞便中Vimentin基因以及SFRP2基因甲基化的研究較多〔7〕，也一定程度上證實了兩種基因甲基化檢測的可行性，但結果并不十分樂觀。UNC5H基因表達神經(jīng)生長因子受體netrin-1，受體的表達情況可能與腸癌、腎癌以及乳腺癌等多種癌癥有關，其中與大腸癌最為相關的是UNC5A和UNC5C兩個亞型〔4〕。

本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者糞便UNC5C 區(qū)域1和區(qū)域2均呈現(xiàn)甲基化，健康人群均無廣泛甲基化，但仍有部分甲基化。提示UNC5H基因甲基化的狀態(tài)和大腸癌的發(fā)生相關，糞便中UNC5H基因甲基化在早期就開始發(fā)生，可能與早期的癌癥發(fā)生有關〔8〕。相關研究結果也提示，糞便中UNC5H基因甲基化的狀態(tài)檢測能早期檢測大腸癌的癌前病變〔9，10〕。另外，大腸癌患者糞便中UNC5H基因甲基化陽性檢出率與臨床病理特征無顯著相關性，總體與其他學者的研究相符〔8，11〕，顯示了糞便中UNC5H基因甲基化檢測的相對穩(wěn)定性。

4 參考文獻

1朱其勇，吳 可，黃海寧，等.T3期大腸癌患者新輔助化療與手術前后外周血T細胞亞群變化的研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013；13(12)：2261-4.

2Lv D，Zhao W，Dong D，etal.Genetic and epigenetic control of UNC5C expression in human renal cell carcinoma〔J〕.Eur J Cancer，2011；47(13)：2068-76.

3Purohit AA，Li W，Qu C，etal.Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM) associates with uncoordinated-5C (UNC5C) in netrin-1-mediated growth cone collapse〔J〕.J Biol Chem，2012；287(32)：27126-38.

4武 潔，陳學軍.Netrin-1受體UNC5C和DCC抑癌作用的研究進展〔J〕.生命科學，2009；4(1)：112-5.

5Kim D，Ackerman SL.The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons〔J〕.J Neurosci，2011；31(6)：2167-79.

6Auger ML，Schmidt ER，Manitt C，etal.unc5c haploinsufficient phenotype：striking similarities with the dcc haploinsufficiency model〔J〕.Eur J Neurosci，2013；38(6)：2853-63.

7劉旭東.大腸癌中Netrin-1依賴性受體DCC、UNC5C表達與細胞凋亡的相關性研究〔D〕.天津：天津醫(yī)科大學碩士論文，2006.

8Dillon AK，Jevince AR，Hinck L，etal.UNC5C is required for spinal accessory motor neuron development〔J〕.Mol Cell Neurosci，2007;35(3)：482-9.

9武 潔，陳學軍，薛占瑞，等.大腸癌組織中unc5c基因啟動子甲基化的分析〔J〕.腫瘤防治研究，2010;37(6)：683-6.

10王乾華，朱劍文，鐘少平，等.UNC5B在人早孕胎盤微血管內皮細胞中的表達及意義〔J〕.中國婦幼保健，2010;13(36)：5454-6.

11Kury S,Garrec C,Airaud F,etal.Evaluation of the colorectal cancer risk conferred by rare UNC5C alleles〔J〕.World J Gastroenterol，2014;20(1)：204-13.