激活δ阿片受體對大鼠腦缺血再灌注損傷中白介素-6和腫瘤壞死因子-α的影響

龐桂珍

(承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000)

白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α是腦缺血再灌注(I/R)損傷中主要的炎性細(xì)胞因子，由于其趨化作用，使白細(xì)胞由血管內(nèi)向缺血區(qū)腦組織遷移，加重腦組織損傷。IL-6、TNF-α介導(dǎo)腦缺血再灌注(I/R)的炎性反應(yīng)以及與之相關(guān)的毒性氧自由基、酸中毒等反應(yīng)，這些共同作用下，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死、腦組織損傷。有報(bào)道稱，應(yīng)用δ阿片受體激動(dòng)劑D-丙(2)-D亮(5)腦非肽(DADLE)可以改善這種I/R損傷，而應(yīng)用δ阿片受體拮抗劑可以阻斷這種效應(yīng)〔1〕。至于δ阿片受體激動(dòng)劑對缺血性腦損傷的作用和機(jī)制，至今仍然不能定論。本研究觀察DADLE對腦缺血的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 美國產(chǎn)420藍(lán)色單股心血管外科尼龍絲線作為血管內(nèi)栓塞用線，頭端燙成光滑球形，直徑約0.12 mm，消毒備用。DADLE、納曲吲哚、氯化三苯四氮唑(TTC) 購自Sigma公司，用磷酸緩沖液(PBS) 0.12 mol/L配制成2%TTC溶液(pH值保持在7.15)，避光保存。IL-6和TNF-α試劑盒購自武漢博士德試劑公司。

1.2模型制備 SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量225～275 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)許可證號：SCXK(京)2002-0003，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。采用改進(jìn)的Longa線栓法〔2〕。大鼠經(jīng)水合氯醛(35 mg/100 g)腹腔注射麻醉后，手術(shù)鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，充分顯露頸總動(dòng)脈分叉處、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在近心端距離分叉處大約4 mm處，做一小的切口，插入血管內(nèi)栓塞線，繼而進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長度為22.5～23.5 mm，直至大腦前動(dòng)脈的近端，完全阻斷大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng)。再灌注時(shí)，輕柔回抽血管內(nèi)栓塞線，直至頸總動(dòng)脈分叉處。手術(shù)操作過程中，保持室溫25 ℃左右，白熾燈照射動(dòng)物，維持肛溫在36℃～38℃，直至大鼠恢復(fù)活動(dòng)。模型成功的標(biāo)志：①右側(cè)Horner征(眼球下陷)；②左側(cè)出現(xiàn)以前肢為重的偏癱。除了僅插入血管內(nèi)栓塞線大約10 mm外，假手術(shù)組手術(shù)過程同上，不會(huì)導(dǎo)致大腦中動(dòng)脈的閉塞。

1.3動(dòng)物分組 24只大鼠隨機(jī)分為四組，分別為假手術(shù)組、模型組、DADLE組、DADLE+納曲吲哚組，每組6只。其中假手術(shù)組不阻斷頸總動(dòng)脈血流、不給藥；模型組缺血1 h，回抽栓線，再灌注6 h；DADLE組在缺血1 h后，靜脈注射DADLE 3 mg/kg〔3～5〕，然后繼續(xù)再灌注直至6 h；DADLE+納曲吲哚組在缺血1 h后，靜脈注射DADLE 3 mg/kg+納曲吲哚 15 mg/kg，然后繼續(xù)再灌注直至6 h。再灌注達(dá)到6 h后，各組動(dòng)物斷頭處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.4神經(jīng)功能評分 根據(jù)6個(gè)神經(jīng)功能等級進(jìn)行評分〔6〕。5分：將大鼠尾部輕輕提起，懸至距離地面大約1 m處，雙前肢伸向地面，并且沒有其他神經(jīng)病學(xué)特征；4分：對側(cè)前肢保持持續(xù)性彎曲狀態(tài)，表現(xiàn)為由輕度前肢彎曲、肩關(guān)節(jié)內(nèi)收到完全的前肢彎曲、肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋等不同程度的癥狀；3分：將大鼠置于軟塑封紙上，使大鼠前爪可以牢牢抓住，拉住大鼠尾部，輕輕側(cè)推其肩膀，使前肢側(cè)劃，重復(fù)數(shù)次，癱瘓側(cè)抵抗側(cè)推的能力下降；2分：大鼠置于地面上，拉其尾部時(shí)，大鼠向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；1分：大鼠置于地面上自由行動(dòng)時(shí)，向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；0分：大鼠置于地面上，沒有自發(fā)活動(dòng)。每組對應(yīng)分值為每組各個(gè)動(dòng)物神經(jīng)功能評分的平均值。

1.5腦梗死體積測定 各組大鼠缺血1 h，再灌6 h后，過度麻醉后，迅速斷頭取腦，置-70 ℃冰箱速凍10 min。從前腦額極到枕極切成5片等厚的冠狀腦片，每片厚度約2 mm，立即置于含有2%TTC的PBS中，37%恒溫孵育30 min，孵育期間注意保持避光狀態(tài)，然后用4%多聚甲醛固定2 h。正常腦組織被染成鮮紅色，而梗死區(qū)則被染成蒼白色。根據(jù)切片順序，將固定的腦片排列，應(yīng)用Motic Med 610型病理圖像分析儀，測量前腦總面積和腦梗死面積，根據(jù)公式V=t(A1+A2+A3+A4+A5+A6)-t(A1+A6)/2，計(jì)算前腦總體積和梗死體積。其中t為切片厚度，A為梗死面積〔2〕。

1.6IL-6和TNF-α的測定 應(yīng)用ELISA檢測血清IL-6、TNF-α水平。大鼠斷頭取血5 ml，低溫離心15 min，分離血清，-20℃保存待測。檢測時(shí)，室溫下解凍，并確保樣品均勻地充分解凍，然后按試劑盒說明檢測IL-6,TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度DADLE對I/R大鼠神經(jīng)功能評分的影響 DADLE 0.3，1，3 mg/kg對I/R大鼠的神經(jīng)功能評分具有劑量依賴性，隨著劑量增加，評分降低(分別為4.19±0.62、3.84±0.47、2.51±0.30)；而DADLE 3～27 mg/kg對缺血再灌大鼠的神經(jīng)功能評分隨著劑量增加(9、27 mg/kg DADLE組神經(jīng)功能評分為3.77±0.38、4.21±0.55)，神經(jīng)功能評分相應(yīng)增加。說明DADLE的最佳作用劑量為3 mg/kg。

2.2DADLE對I/R大鼠神經(jīng)功能評分的影響 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分明顯降低(2.69±0.21、5.00±0.05，P<0.01)；與模型組相比，DADLE組的神經(jīng)功能評分升高了42.0%(3.82±0.18，P<0.01)，而納曲吲哚可以抑制DADLE的作用，明顯降低神經(jīng)功能評分(2.51±0.12，P<0.01)，同時(shí)加重造模損傷。說明DADLE通過δ阿片受體，升高神經(jīng)功能評分。

2.3DADLE對I/R大鼠腦梗死體積的影響 正常腦組織被染成鮮紅色，而梗死區(qū)則被染成蒼白色。與假手術(shù)組相比，模型組的腦梗死灶體積和與前腦總體積的體積比明顯增大(P<0.01)；與模型組相比，DADLE組的腦梗死灶體積減少了60.9%，體積比降低了40.0%(P<0.01)，而納曲吲哚可以抑制DADLE的作用，明顯增加了腦梗死灶體積和體積比(P<0.01)，同時(shí)加重造模損傷。說明DADLE通過δ阿片受體，減少腦梗死灶的體積。見圖1，表1。

2.4DADLE對I/R大鼠細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，DADLE組IL-6、TNF-α水平分別降低了33.8%和25.8%(P<0.01)，而納曲吲哚可以抑制DADLE的作用，明顯降低IL-6、TNF-α水平(P<0.01)，同時(shí)加重造模損傷。說明DADLE通過δ阿片受體，降低IL-6和TNF-α水平。見表2。

表1 DADLE對I/R大鼠腦梗死體積的影響

表2 DADLE對I/R大鼠細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平的影響

圖1 TTC染色DADLE對I/R大鼠腦梗死的影響

3 討 論

本研究結(jié)果表明，激活δ阿片受體，對腦I/R大鼠的腦損傷具有保護(hù)作用，而阻斷δ阿片受體則對保護(hù)作用起到抑制，從而加重腦損傷。DADLE通過激活δ阿片受體，抑制炎性細(xì)胞因子的作用，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。δ阿片受體激動(dòng)劑DADLE可以延長外周器官存活，保護(hù)中樞系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞〔7〕。研究表明，δ阿片受體激動(dòng)劑DADLE與多器官的I/R損傷有密切的關(guān)系〔8〕。有報(bào)道稱，DOR的神經(jīng)保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)PKC-MAPK通路有關(guān)〔9〕。然而，DADLE對腦I/R注的保護(hù)作用的作用機(jī)制還不是很清楚，需進(jìn)一步研究。

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