骨碎補(bǔ)總黃酮預(yù)處理轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞修復(fù)兔橈骨缺損的效果

張 力 王 偉

(錦州市中心醫(yī)院 遼寧醫(yī)學(xué)院錦州臨床學(xué)院骨科，遼寧 錦州 121000)

骨缺損主要由創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤的外科治療所導(dǎo)致，是引起功能喪失并影響生活質(zhì)量的主要原因。其治療通常采用的是自體骨移植、同種異體骨移植、帶血供的游離骨移植和生物材料替代等方法〔1，2〕。理想的骨修復(fù)材料應(yīng)通過骨形成、骨傳導(dǎo)作用和骨誘導(dǎo)作用三重機(jī)制促進(jìn)骨的愈合并具有良好的生物相容性。自體來源的種子細(xì)胞或修復(fù)材料構(gòu)建組織工程骨存在來源有限、體外需大量擴(kuò)增、增加患者等待時(shí)間等不足〔3〕。目前，引導(dǎo)性骨再生已成為修復(fù)骨缺損的一種重要手段，其中微囊逐漸被用作骨科藥物和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的載體，在組織移植與骨缺損修復(fù)方面發(fā)揮積極的作用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)采用微囊化技術(shù)將經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染和中藥預(yù)處理的大鼠成肌細(xì)胞作為修復(fù)的材料，植入兔橈骨缺損處引導(dǎo)骨再生，驗(yàn)證該材料的生物安全性，并為構(gòu)建新型組織工程骨提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量(2.3±1.5)kg，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2003-2007)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 海藻酸鈉、多聚賴氨酸(美國(guó)Sigma公司)；BMP-2因子(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(HA凝膠)，上海其勝生物制劑有限公司；速眠新Ⅱ號(hào)(長(zhǎng)春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所)；注射用青霉素鈉(規(guī)格：80萬單位，華北制藥股份有限公司)；注射用硫酸慶大霉素(規(guī)格：8萬單位，上海新先鋒藥業(yè)有限公司)。

1.3主要儀器及設(shè)備 倒置熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)、掃描電子顯微鏡(JSM-35CF型)(日本電子公司)、手術(shù)器械、醫(yī)用線鋸、7#醫(yī)用縫合線等(錦州市中心醫(yī)院手術(shù)室提供)、OLYMPUS顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、CAIS-1000圖像分析系統(tǒng)(瑞典LKB公司)

1.4方法

1.4.1AFDR預(yù)處理轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞的制備及微囊化細(xì)胞的檢測(cè) 改良法體外分離培養(yǎng)大鼠成肌細(xì)胞，參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予CNTF成肌細(xì)胞低劑量AFDR給藥濃度(67.5 mg·kg-1·d-1)〔5〕制備低濃度AFDR含藥血清。分別取經(jīng)或未經(jīng)AFDR預(yù)處理的轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞，經(jīng)干預(yù)后置換出微粒核心中的鈣離子獲得微囊化轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞和微囊化AFDR預(yù)處理的轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞。獲得微囊后于無菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察微囊化細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2負(fù)載BMP的HA載體的制備及檢測(cè) 凍干BMP-2粉末與生理鹽水按50 mg∶1.5 ml的比例調(diào)成BMP-2混懸液，然后按0.45 ml∶1 ml的配比將BMP-2混懸液與HA凝膠混勻，制備成負(fù)載BMP-2因子的載體復(fù)合物，冷藏備用，按照前期實(shí)驗(yàn)方法取部分標(biāo)本掃描電鏡下觀察載體復(fù)合物形態(tài)〔6〕。

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型構(gòu)建 清潔新西蘭大白兔24只，根據(jù)處置條件隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，每組6只動(dòng)物，于左前臂造模，右前臂作正常對(duì)照組。

速眠新肌肉注射麻醉新西蘭大白兔，取前臂內(nèi)側(cè)切開3 cm縱形切口，充分顯露橈骨中段，電鋸造成約15 mm節(jié)段骨缺損(帶骨膜)，造成公認(rèn)的兔橈骨缺損模型。Ⅰ組注入1 ml負(fù)載BMP的HA凝膠，并于其中注入AFDR預(yù)處理轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞微囊懸液50 μl(約200個(gè)微囊，細(xì)胞數(shù)約1×105)；Ⅱ組注入1 ml負(fù)載BMP的HA凝膠，并于其中注入轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞微囊懸液50 μl(約200個(gè)微囊，細(xì)胞數(shù)約1×105)；Ⅲ組注入1 ml負(fù)載BMP的HA凝膠，并于其中注入生理鹽水50 μl；Ⅳ組植入1 ml HA凝膠，并于其中注入生理鹽水50 μl。

術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素、慶大霉素肌注預(yù)防感染，動(dòng)物不予外固定，分籠飼養(yǎng)，不限制活動(dòng)。

1.4.4動(dòng)物術(shù)后大體及標(biāo)本觀察 術(shù)后連續(xù)觀察兔的傷口愈合情況及其活動(dòng)狀況，術(shù)后8、12 w分別處死2只動(dòng)物取實(shí)驗(yàn)側(cè)橈骨標(biāo)本，觀察移植區(qū)大體標(biāo)本的顏色、質(zhì)地、血管形成、宿主骨界面和周圍軟組織覆蓋移植物等情況。

1.4.5組織學(xué)觀察 取術(shù)后12 w動(dòng)物實(shí)驗(yàn)側(cè)橈骨標(biāo)本，10%多聚甲醛固定、10%硝酸脫鈣、石蠟包埋，然后連續(xù)橫行及縱行切片，切片厚度為5 μm，行HE染色，在100倍光鏡下觀察結(jié)合部及異體骨周圍骨愈合情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1微囊化細(xì)胞觀察及細(xì)胞存活率測(cè)定 倒置相差顯微鏡下見制備的細(xì)胞微囊大小比較均一，直徑500～800 μm，呈球形，邊界規(guī)整清楚，囊內(nèi)細(xì)胞折光性強(qiáng)。約75%的微囊包含細(xì)胞，約50～100個(gè)/囊，其余為空囊，見圖1。

2.2負(fù)載BMP的HA載體掃描電鏡(SEM)觀察 實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HA凝膠載體有良好的組織相容性，可以制成一定的物理構(gòu)形，負(fù)載BMP的HA凝膠載體可見BMP顆粒均勻附著于HA凝膠多孔結(jié)構(gòu)中，可促進(jìn)骨組織的再生，使新生骨的塑形和改建能夠順利完成(圖2)。

圖1 微囊化細(xì)胞形態(tài)觀察(倒置相差顯微鏡，×40)

圖2 負(fù)載BMP的HA凝膠(SEM，×1 000)

2.3動(dòng)物術(shù)后觀察及大體標(biāo)本觀察結(jié)果 Ⅲ組中有1只動(dòng)物出現(xiàn)傷口感染延遲愈合，其余動(dòng)物均飲食正常，均一期愈合，切口處縫線自行脫落。

術(shù)后8 w，Ⅰ、Ⅱ組骨缺損斷端組織融合良好，有較多硬度較高的類骨樣組織；Ⅲ組則僅見少量類骨質(zhì)生成，其硬度不及Ⅰ、Ⅱ組；Ⅳ組植入物與宿主的界限清晰，表面僅有一層較致密的纖維組織膜包裹，仍有活動(dòng)性。見圖3。

圖3 術(shù)后動(dòng)物橈骨大體標(biāo)本觀察

術(shù)后12 w，Ⅰ組骨缺損區(qū)與宿主骨融為一體，修復(fù)邊緣規(guī)整，新生骨直徑與鄰近宿主骨直徑相當(dāng)；Ⅱ組出現(xiàn)連續(xù)性新骨生成，但直徑較細(xì)；Ⅲ組修復(fù)區(qū)骨直徑較小，修復(fù)后新骨塑形欠佳；Ⅳ組骨缺損區(qū)斷端只見少許新生骨，缺損區(qū)被纖維結(jié)締組織連接。見圖3。

2.4病理組織HE染色光鏡觀察結(jié)果 術(shù)后12 w，Ⅰ組植入物與宿主骨交界處骨小梁排列整齊被新生骨組織占據(jù)，皮質(zhì)骨形成良好，缺損區(qū)編織骨轉(zhuǎn)化為板層骨，有大量骨陷窩(箭頭A示)、中央管(箭頭B示)形成；Ⅱ組骨小梁排列均勻，缺損區(qū)編織骨轉(zhuǎn)化為板層骨，可見大量成熟編織骨，骨小梁周圍成骨細(xì)胞(箭頭示)生長(zhǎng)活躍；Ⅲ組呈均勻性成骨現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞和少量多核細(xì)胞浸潤(rùn)，但骨小梁、編織骨數(shù)量較前兩組差，偶可見哈佛斯系統(tǒng)(箭頭示)及中央管；Ⅳ組可見HA凝膠基本吸收，有大量纖維結(jié)締組織(箭頭示)、新生血管較少，邊緣可見少量骨組織和軟骨組織。見圖4。

圖4 術(shù)后12 w不同組兔橈骨缺損愈合情況(HE，×200)

3 討 論

引導(dǎo)性骨再生是組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)骨缺損的創(chuàng)新方法之一，改變了治療骨缺損的傳統(tǒng)治療模式，為骨缺損的修復(fù)重建提供了新的思路；而利用體外基因修飾技術(shù)，使細(xì)胞在骨缺損修復(fù)局部發(fā)揮成骨效應(yīng)，是一種局部基因治療的概念。骨缺損的修復(fù)再生過程復(fù)雜，修復(fù)材料的選擇是修復(fù)的關(guān)鍵，我國(guó)已建立了多個(gè)同種異體骨庫(kù)，很多同種異體骨材料已廣泛應(yīng)用于臨床，且獲得了滿意的臨床療效〔7，8〕。隨著組織工程學(xué)及中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)的發(fā)展，骨碎補(bǔ)廣泛應(yīng)用于骨損傷修復(fù)，大量研究表明AFDR具有在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用〔9〕，因此本實(shí)驗(yàn)選擇微囊化AFDR預(yù)處理轉(zhuǎn)CNTF成肌細(xì)胞，即采用微囊化技術(shù)將經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染和中藥預(yù)處理大鼠成肌細(xì)胞使構(gòu)建的組織工程骨兼具骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，以更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)骨缺損的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，微囊化細(xì)胞存活率良好，不僅未影響藥物和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的活性，應(yīng)用于骨修復(fù)后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活良好，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

骨總黃酮具有促進(jìn)體外成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制成骨細(xì)胞凋亡的作用，且在骨缺損過程中對(duì)血清堿性磷酸酶、鈣、磷及肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平產(chǎn)生影響，微囊則在移植部位保護(hù)了移植細(xì)胞避免受到局部血腫壓迫引發(fā)的損傷〔10〕。通過動(dòng)物取材檢測(cè)可見Ⅰ、Ⅱ骨缺損處，不僅橋接部有成骨，并在成骨性因子BMP的作用下形成新骨，并形成新生骨痂形成，且各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)明顯優(yōu)于BMP因子與HA凝膠復(fù)合組。

細(xì)胞因子結(jié)合功能細(xì)胞替代治療以及微囊化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植在骨外科的研究越來越多，通過本研究觀察可見，在組織移植與骨損傷修復(fù)方面也發(fā)揮積極的作用。然而，本實(shí)驗(yàn)也由于時(shí)間限制，在微囊化技術(shù)方面進(jìn)作了初步的應(yīng)用，未能進(jìn)行長(zhǎng)期觀察體內(nèi)的遠(yuǎn)期定植，需進(jìn)一步深入探究。

4 參考文獻(xiàn)

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