激活 SHH 通路對(duì)急性腦缺血大鼠SYN、GAP-43的影響

劉花艷 婁季宇 曾志磊 陳苗苗 牛廣義

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 鄭州 450014)

腦缺血后神經(jīng)可塑性尤其是突觸再生近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)，突觸再生可能是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)最重要的步驟。Keifer等〔1〕在海馬中研究發(fā)現(xiàn)突觸再生是潛在學(xué)習(xí)和記憶的主要機(jī)制，對(duì)于神經(jīng)元損傷后的恢復(fù)有重要意義。Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)是胚胎發(fā)育、組織再生的重要調(diào)節(jié)器，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和軸突導(dǎo)向參與胚胎發(fā)育和出生后的修復(fù)，與突觸再生有著密切的聯(lián)系〔2〕。SHH對(duì)血管神經(jīng)單元具有內(nèi)源性抗炎作用，它的異?？梢灾苯訉?dǎo)致突觸再生障礙，最終不利于神經(jīng)功能的恢復(fù)〔3〕。SYN是分布于突觸囊泡膜上含量豐富的糖蛋白之一,影響著突觸可塑性，既是突觸發(fā)生的標(biāo)志,又是突觸傳遞效能水平的反映，其免疫定位與定量可以準(zhǔn)確反映突觸的分布與密度〔4〕。GAP-43是神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和再生的特異性指標(biāo)，是決定神經(jīng)再塑的內(nèi)在因素。目前對(duì)SHH 信號(hào)通路在腦缺血后突觸再生的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)擬用SHH信號(hào)通路的激活劑purmorphamine，觀察其對(duì)大鼠缺血腦組織突觸再生的相關(guān)因子SYN、GAP-43的影響，為缺血性腦血管病的神經(jīng)功能恢復(fù)提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1材料 由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性SD大鼠76只，清潔級(jí)，體重280～350 g。purmorphamine粉劑(CAS Resistry NO.:483367-10-8)由上海浩然生物試劑有限公司提供。使用前先用DMF溶解，再用PBS溶液稀釋。SYN兔抗鼠多克隆抗體，由美國(guó)SANTA CRUZ提供。SP9000試劑盒、DAB試劑盒由北京中杉生物工程公司提供。PCR試劑盒、內(nèi)參β-actin、DEPC水、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。

1.2模型與分組 參照Z(yǔ)ea longa〔5〕等報(bào)道的線栓法制作SD大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。實(shí)驗(yàn)分為A組(假手術(shù)組，n=12)、B組(模型組，n=32)、C組(藥物組，n=32)。其中B組和C組按缺血時(shí)間分為4個(gè)亞組即6、24、72 h、7 d，每亞組8只。C組于術(shù)后按0.69/mg給予purmorphamine溶液腹腔注射，A組和B組于術(shù)后給予等劑量的DMF溶液注射。

1.3標(biāo)本制備 10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心臟灌洗固定24 h備用。石蠟包埋后連續(xù)切片，制備成4 μm厚度切片。

1.4免疫組化測(cè)定缺血半暗帶區(qū)域SYN和GAP-43的表達(dá) 采用SP法，按照說(shuō)明書(shū)操作。每張切片隨機(jī)選取10×40視野5個(gè)，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)得出陽(yáng)性區(qū)平均灰度值。

1.5RT-PCR 檢測(cè)缺血半暗帶內(nèi)GLi1 mRNA。10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，液氮冷凍后放置-80℃冰箱保存。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腦組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為5'CCCTTCTTTAGGATTCCCACC3'，下游引物為5'CGGCAGTCCGTCTCATACAC3'，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6 min。實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為內(nèi)參。GLi1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為324 bp，電泳鑒定后采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算目的基因GLi1與β-actin的DNA條帶灰度比值。

2 結(jié) 果

2.1GLi1 mRNA表達(dá)情況 與A組比較，B組和C組GLi1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；B組皮質(zhì)缺血區(qū)GLi1 mRNA于6 h后開(kāi)始升高，24 h達(dá)高峰，之后有所下降但維持在較高水平。C組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)GLi1 mRNA與B組相比顯著增高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2SYN表達(dá)情況 可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積在神經(jīng)細(xì)胞表面，此為SYN 陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)中僅有較弱的反應(yīng)。缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)灰度值在6 h開(kāi)始降低，72 h最顯著，7 d后開(kāi)始上升，與A組相比各時(shí)間點(diǎn)明顯降低(P<0.05)。C組在缺血后6、24、72 h、7 d時(shí)SYN的表達(dá)明顯高于B組(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表1 大鼠腦組織中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)GLi1 mRNA 表達(dá)

表2 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)SYN表達(dá)(平均陽(yáng)性區(qū)灰度值)

2.3GAP-43表達(dá)情況 可見(jiàn)皮質(zhì)區(qū)GAP-43的免疫活性較其他部位高,呈小點(diǎn)狀或細(xì)顆粒狀沉積。A組大鼠在皮質(zhì)和部分腦區(qū)GAP-43均有表達(dá),且雙側(cè)對(duì)稱(chēng)，在丘腦及其腦白質(zhì)區(qū)GAP-43表達(dá)很低。其中缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GAP-43的免疫活性在缺血后6 h表達(dá)量開(kāi)始上升，72 h升高最為顯著，7 d后開(kāi)始下降，與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大腦皮質(zhì)GAP-43在6、24、72 h、7 d免疫活性明顯高于B組(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖3。

表3 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)GAP-43表達(dá)(平均陽(yáng)性區(qū)灰度值)

A組

B組

C組

圖2 B、C兩組不同時(shí)點(diǎn)SYN表達(dá)(×400)

圖3 B、C組不同時(shí)點(diǎn)GAP-43表達(dá)(×400)

3 討 論

近年來(lái)，人們逐步認(rèn)識(shí)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性，正是因?yàn)榇嬖谶@種可塑性，才使得損傷后的腦組織能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)重建、功能代償使腦功能得到恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)SHH信號(hào)通路與突觸再生有著密切的聯(lián)系，抑制SHH信號(hào)可以加重急性缺血性中風(fēng)引起的腦損傷〔6〕。鞘內(nèi)注射SHH蛋白增加了大腦室管膜下區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，促進(jìn)中風(fēng)后的功能恢復(fù)〔7〕。在參與突觸再生中，SHH可能是通過(guò)和受體Ptch結(jié)合引起Smo蛋白的活化，終于導(dǎo)致GLi鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Gli家族包括GLi1、GLi2 和GLi3，GLi1的表達(dá)在Hedgehog信號(hào)通路起到始動(dòng)開(kāi)關(guān)的作用。 在突觸的發(fā)育中，SHH起著重要作用〔8〕，Tao-Cheng等〔9〕在成人的突觸內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ptch和Smo存在于突觸小泡中，參與突觸的再生。在缺血腦損傷初期，增加SHH蛋白能刺激突觸再生，為受損的組織提供營(yíng)養(yǎng)及促進(jìn)功能的恢復(fù)〔10〕。另外，SHH的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過(guò)多種機(jī)制增加神經(jīng)祖細(xì)胞增殖〔11〕，其中包括抗氧化和抗凋亡，而且還可以通過(guò)其他受體的角色潛在的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

purmorphamine是SHH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活劑，可與通路的Smo結(jié)合使其空間構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活下游分子GLi。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腦缺血后加入 purmorphamine 后激活了下游轉(zhuǎn)錄因子GLi1 mRNA 的表達(dá)，從而激活SHH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SYN是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白,是神經(jīng)出芽反映的代表性結(jié)構(gòu)蛋白,常被作為突觸重建和神經(jīng)可塑性的重要標(biāo)志物之一。GAP-43是神經(jīng)組織中特有的一種糖蛋白，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的軸突生長(zhǎng)和突觸形成有重要作用〔12〕，在正常腦組織中GAP-43很少表達(dá)，只有在損傷情況下才增高。本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血應(yīng)用 SHH信號(hào)通路激活劑后，大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)GAP-43、SYN免疫活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)明顯高于模型組，并且上調(diào)峰值，提示purmorphamine對(duì)腦缺血后大鼠腦的可塑性產(chǎn)生了影響，對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)及突觸代償有促進(jìn)作用。推測(cè)激活SHH信號(hào)通路可能是一種潛在的腦血管病治療的新方法。

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