電針對膝骨性關(guān)節(jié)炎家兔模型軟骨細(xì)胞凋亡的影響

韋桂勇 黃 劍 彭支蓮 丁 盼 肖 龍 鄭玲玲 冉 婭

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是臨床中常見的骨關(guān)節(jié)疾病。以反復(fù)出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)慢性疼痛并逐漸影響關(guān)節(jié)活動為特點。早期以關(guān)節(jié)慢性磨損而出現(xiàn)軟骨退行性改變，逐漸繼發(fā)滑膜和骨質(zhì)的退變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的嚴(yán)重受損，嚴(yán)重影響患者的生活。有研究報道，細(xì)胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨退行性過程中起著重要的作用〔1〕。 針灸在KOA的防治方面具有獨特的療效，本研究通過觀察電針對KOA家兔模型軟骨細(xì)胞凋亡的影響，探討針刺治療KOA的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭大白兔36只，體重2.0～2.5 kg，雌雄各半，隨機分為4組，分別為正常組(A組)、模型組(B組)、電針組(C組)、氨基葡萄糖膠囊組(D組),每組9只。由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SYXK(渝)2012-0001。

1.2實驗器械及試劑 SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針灸儀；日本OLYMPUS公司 BX40型光學(xué)顯微鏡，BX51型正置顯微鏡。TUNEL試劑盒購于美國Roche公司；蛋白酶k購于美國Sigma公司； DAB顯色劑試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3建立動物模型 家兔在穩(wěn)定條件下飼養(yǎng)一周，除正常組外，其他三組參照張洪等〔2〕介紹的膝關(guān)節(jié)石膏制動法造模。剪掉三組動物左下肢踝關(guān)節(jié)以上的兔毛，左后肢伸直位用管型石膏固定，用透明膠紙封好石膏外緣，防止家兔撕咬，如果石膏脫落或松動者及時重新固定。制動6 w后，隨機從各組中抽取1只家兔處死，解剖左膝關(guān)節(jié)取關(guān)節(jié)軟骨做HE染色觀察造模情況，確認(rèn)造模成功后解除石膏制動。

1.4針刺方法 動物造模成功后，參照《實驗針灸學(xué)》〔3〕和《實驗動物針灸手冊》〔4〕，以及鄭利巖等《實驗家兔經(jīng)穴定位的標(biāo)準(zhǔn)化研究系列報道》〔5〕，將C組動物選取“足三里、犢鼻、血海、陽陵泉、膝眼和梁丘”六個穴位。剃除上述穴位處兔毛，常規(guī)酒精消毒后，用1寸毫針進(jìn)行針刺，直刺或斜刺15～30 mm，得氣后，針柄接電針治療儀，疏密波型，頻率2～100 Hz，強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度。每次電針兩組，每次留針20 min，每日1次，連續(xù)治療3 w； D組：解除制動后，氨基葡萄糖膠囊溶于蒸餾水后，按90 mg/kg〔6〕口服，每天一次，共3 w。A、B組：正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)。

1.5組織學(xué)檢查 治療結(jié)束后隨機從各組中抽出1只兔子處死，處死后立即切取家兔脛骨平臺關(guān)節(jié)面的完整軟骨及軟骨下骨組織標(biāo)本，用10%的甲醛溶液固定48 h，脫鈣2～3 d，石蠟縱向包埋固定，常規(guī)切片，HE染色。在光鏡下學(xué)進(jìn)行滑膜、軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.6軟骨細(xì)胞凋亡的測定 治療結(jié)束后處死各組動物，立即解剖左側(cè)膝關(guān)節(jié)，用銳刀片切1 cm×1 cm 取股骨內(nèi)髁全層軟骨，置10%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)切片，厚度為5 μm，置于40℃水浴展片，撈片后于60℃烘烤箱中烘片2 h以使切片緊密黏附，按照試劑盒說明，采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)測定軟骨細(xì)胞凋亡。陽性判定：細(xì)胞核為棕黃色顆粒。 每張切片隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) =TUNEL標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)/軟骨細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1病理觀察 造模后從各組家兔中隨機取出1只處死, A組解剖后觀察到：膝關(guān)節(jié)表面光滑呈淡藍(lán)色；B、C、D組動物關(guān)節(jié)軟骨面粗糙呈黃色，有骨贅增生，邊緣骨質(zhì)破壞。病理切片采用HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)A組動物膝關(guān)節(jié)面表層平整、光滑，軟骨細(xì)胞序列整齊，分布均勻，層次清楚。造模后B、C、D三組均出現(xiàn)軟骨表面不光滑、纖維化，中間層有裂隙，細(xì)胞排列紊亂，潮線不規(guī)則，簇集細(xì)胞出現(xiàn)。Mankin評分為6分，達(dá)到中期KOA標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，表明造模成功。見圖1。

2.2TUNEL法檢測軟骨細(xì)胞凋亡 圖2可見，家兔膝關(guān)節(jié)伸直位固定6 w后，軟骨細(xì)胞的過度凋亡，說明細(xì)胞凋亡在兔KOA發(fā)病過程中起著重要作用。C組經(jīng)治療后與B組比較細(xì)胞凋亡降低，與B組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)，說明電針能有效抑制KOA病理過程中軟骨細(xì)胞的凋亡。A組各時間段均未檢出家兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的異常凋亡，AI為(4.81±0.93)%；B、C、D三組造模后軟骨細(xì)胞均過度凋亡，AI分別為(22.11±2.35)%、(17.90±1.84)%、(19.53±1.10)%，B組與A組比較有顯著差異(P<0.01)。

圖1 各組家兔模型軟骨標(biāo)本HE染色

圖2 光鏡下各組家兔模型軟骨標(biāo)本凋亡情況

3 討 論

本實驗采用新西蘭大白兔左后肢伸直位石膏固定法建立KOA模型，使得關(guān)節(jié)面壓力增加，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞功能紊亂，軟骨與滑膜產(chǎn)生粘連，軟骨細(xì)胞營養(yǎng)缺失，從而影響軟骨的潤滑。本實驗提示膝關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)中度退行性改變。因此，關(guān)節(jié)制動法造模能較好地反映KOA的臨床狀態(tài)。

正常情況下,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡與增殖處于動態(tài)平衡，使關(guān)節(jié)軟骨在總體上保障其細(xì)胞數(shù)量，形態(tài)和功能的穩(wěn)定。近年來發(fā)現(xiàn)OA存在不同程度的軟骨細(xì)胞過度凋亡，且與病變程度有關(guān)。裴明等〔8〕取OA關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)原位雜交及原位末端標(biāo)記法檢測X型膠原表達(dá)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)軟骨退變時，軟骨細(xì)胞表達(dá)X型膠原， 同時存在軟骨細(xì)胞凋亡。Blaw等〔9〕對正常人和OA病人關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)OA病人軟骨細(xì)胞中有典型的細(xì)胞凋亡，主要分布于軟骨的表層和中層，有細(xì)胞凋亡的軟骨呈現(xiàn)糖蛋白缺失，凋亡數(shù)量與OA分級明顯相關(guān)。認(rèn)為軟骨細(xì)胞凋亡過盛可能是關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)展成骨關(guān)節(jié)病的重要原因之一。胡建華等〔10〕在對骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的bax mRNA表達(dá)上調(diào)的同時，bcl-2 mRNA表達(dá)也顯著增高，認(rèn)為bcl-2和bax共同調(diào)節(jié)了軟骨細(xì)胞的凋亡。本研究表明家兔KOA模型造模過程實際上是膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度凋亡的過程，電針是通過抑制家兔KOA模型軟骨細(xì)胞的過度凋亡，改善膝骨關(guān)節(jié)軟骨的退變，從而達(dá)到治療效果。

KOA屬中醫(yī)學(xué)痹證范疇，《靈樞·九針》曰：“五勞所傷，久立傷骨，久行傷筋，久坐傷肉”的記載?！鹅`樞》云:“經(jīng)脈者，所以行血氣而營陰陽，濡筋骨，利關(guān)節(jié)者也?！薄把蛣t經(jīng)脈流行，營復(fù)陰陽，筋骨勁強，關(guān)節(jié)清利矣。”筆者認(rèn)為KOA多與機體正氣不足，肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)，夾雜風(fēng)寒濕邪痹阻有關(guān)。其主要病機是“虛與阻”,虛主要是血虛、肝腎虛；阻主要是血瘀氣滯，寒凝等。治療宜溫經(jīng)通絡(luò)、行氣止痛，補肝腎為主。KOA在臨床上采用針灸進(jìn)治療，療效獨特。姚志芳等〔11〕在臨床上采用溫針灸血海、梁丘、陰陵泉、陽陵泉、足三里等穴治療KOA與單純針刺法療比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫針灸組的療效優(yōu)于單純針刺組，尤其是對KOA寒痹型患者。谷建林〔12〕用溫針灸加中藥治療KOA 46例，結(jié)果顯效15例，有效25例，無效6例，總有效率86.9%。溫針灸能使溫?zé)嶂畾馔高_(dá)促進(jìn)膝關(guān)節(jié)的局血循環(huán)，祛寒除濕，活血祛瘀，具有止痛和緩解癥狀的作用。何新芳等〔13〕研究針刀療法對KOA兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明針刀療法能抑制兔KOA軟骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)恢復(fù)。

針灸治療能通過對患者膝關(guān)節(jié)周圍穴位的刺激，促進(jìn)機體釋放內(nèi)源性嗎啡呔等鎮(zhèn)痛物質(zhì)，提高痛閾，達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的。電針治療，能使肌肉一收一舒，起到泵的作用，從而改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)經(jīng)氣運行，有利于對滲出液的吸收，有利于關(guān)節(jié)面軟骨的修復(fù)。本研究根據(jù)經(jīng)絡(luò)臟腑辯證，選取“足三里、犢鼻、血海、陽陵泉、膝眼和梁丘”六個穴進(jìn)行治療。足三里、犢鼻循行經(jīng)過膝關(guān)節(jié)，同為足陽明胃經(jīng)穴位，局部取穴有鼓舞氣血、舒筋通絡(luò)的作用。血海為生血、活血的重要穴位。膝者筋之府，陽陵泉為八會穴中的筋會，與足三里、犢鼻、血海相配有養(yǎng)血通絡(luò)，舒筋利關(guān)節(jié)的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Kimura T．Progress of research for osteoarthritis．An overview of the recent knowledge on osteoarthritis：pathogenesis，evaluation and therapies〔J〕.Clin Calcium,2009;19(11)：1565．

2張 洪，江捍平，王大平.關(guān)節(jié)制動制作骨性關(guān)節(jié)炎動物模型的探討〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006；16(12)：1843-4，8.

3李忠仁．實驗針灸學(xué)〔M〕．北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：314．

4胡元亮．實驗動物針灸手冊〔M〕．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：288．

5鄭利巖，甄希成，徐朝霞，等. 實驗家兔經(jīng)穴定位的標(biāo)準(zhǔn)化研究系列報道〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2003;30(1):60-2.

6牟方政，李榮亨，張文亮，等． 復(fù)元膠囊對衰老性骨關(guān)節(jié)炎模型兔血清氧自由基代謝及血液流變學(xué)的影響〔J〕. 中國老年學(xué)雜志，2010;30(12) : 3679-82．

7方 銳，艾力江·阿斯拉，盧艷麗.兔骨性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建及早中晚期的特點〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010;14(7):1218-22.

8裴 明,曲綿城,于長隆等. 凋亡在骨關(guān)節(jié)病發(fā)病機制中的作用〔J〕.中華骨科雜志,1999;11(3):167-9.

9Blaw FJ,Guistian R,Vazguez ME,etal.Osteoarthritis chondrocytes did by apoptosis:a possible pathway for osteoarthritis pathology〔J〕.Arthritis Rheum,1998;41(2):284-9.

10胡建華,黃公怡,黃尚志,等.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞調(diào)控基因的研究〔J〕.中華外科雜志,2000;38(4):266-8.

11姚志芳,黃曉卿,張 煒. 溫針灸與單純針刺治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效觀察比較〔J〕.針灸臨床雜志,2003;19(7):32-3.

12谷建林.溫針灸加中藥治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的體會〔J〕.中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)研究雜志,2003;70(7):11663-4.

13何新芳，明順培，俞 杰,等.針刀療法對膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2006;33(7):894-5.